本发明专利技术一种用于检测缺氧诱导因子的荧光纳米核酸银的制备方法,属于肿瘤细胞检测和核酸试剂制备领域。由合成纳米银簇序列和与HIF有相互作用的识别序列组成的双功能DNA。其次以这种双功能DNA为模板，于柠檬酸钠缓冲溶液中，利用NaBH4还原AgNO3的方法，成功合成了具有荧光的核酸纳米银簇。这种核酸纳米银簇在激发波长为510nm下能发射585nm的荧光，DNA-AgNCs的荧光量子产率为34.4%（以罗丹明B为参照），纳米银簇的大小为~2nm。本发明专利技术利用HIF与特定核酸序列的特异结合，将这种微观结合信号放大为宏观荧光变化，来实现HIF的探测，是一种简便，直观的分析方法。
【技术实现步骤摘要】
—种用于检测缺氧诱导因子的荧光纳米核酸银的制备方法
: 本专利技术属于肿瘤细胞检测和核酸试剂制备领域，特指一种纳米核酸-银簇(DNA-AgNCs)的制备方法及其在用荧光光谱法快速检测细胞中HIF含量的运用。
技术介绍
: 最近几年，纳米银簇(AgNCs)因具有独特的物理学、电学和光学性质，在化学传感、生物传感、成像及诊断等方面的应用，引起了很多的关注。鉴于纳米银易聚集不稳定的特点，用模板来合成较稳定纳米银簇的方法得到了广泛研究，以树枝状大分子、小分子物质、多肽、蛋白质和DNA等为模板,成功的合成了在水中稳定的纳米银簇(J.Sharma, R.C.Rocha,M.Lj Phipps, H.C.Yehj K.A.Balatskyj Dung M.Vuj A.P.Shrevej J.H.Werner,J.S.Martinez, A DNA-templated uorescent silver nanocluster with enhancedstability, Nanoscale, 2012，4，4107 - 4110)。先后有以聚甲基丙烯酸、植酸钠、双功能络合剂(翁建；崔强；丁家包，一种聚甲基丙烯酸微波合成荧光银纳米粒子的方法，中国专利技术专利201010540810.8 ;杨海峰；王娜，具表面增强拉曼散射活性的菜花状纳米金-银合金的制备方法，中国专利技术专利201010133185.5 ;吕荣文；邹伟；张淑芬，对含硝基的爆炸化合物高敏感检测的银纳米簇及其制备，中国专利技术专利201110194650.0,)等为模板合成不同尺寸和用途银纳米粒子。由于Ag+和Ag与DNA上的胞嘧啶有很高的亲和性，以多胞嘧啶核苷酸的DNA为模板可合成稳定、有优异的光谱和光物理性的银簇。DNA不仅是生命体中重要的遗传物质，与蛋白质的翻译和酶的形成有中要关联，还是许多物质的目标分子，因此，基于DNA的纳米银簇(DNA-AgNCs)为探测各种疾病治疗和诊断中重要的分子提供强大平台(H.C.Yeh, J.Sharma, 1.M.Shih, D.M.Vu, J.S.Martinez, J.H.Werner, Afluorescence light-up Ag nanocluster probe that discriminates single-nucleotidevariants by emission color, J.Am.Chem.Soc., 2012, 134, 11550 11558)。 缺氧诱导因子(HIF)是激活线粒体氧化磷酸化和无氧酵解的开关，通过诱导糖酵解酶和葡萄糖转运子基因的表达，激活和促进糖酵解过程。肿瘤细胞中HIF高表达因此，HIF成为肿瘤重要标志之一，探测肿瘤细胞HIF的变化对于肿瘤诊断和治疗具有重大意义。目前HIF-1的体外检测一般采用凝胶电泳的方法，此方法有检测灵敏度较低，操作复杂，周期长等缺点。因此，开发简单快速，灵敏度高，特异性强，准确检测细胞内HIF的分析技术仍然是一个挑战。
技术实现思路
: 本专利技术设计了一种新的脱氧核酸(DNA )序列:5 ’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3 ’，其特点为由合成纳米银簇序列(5 ’ CCTCCTTCCTCC3 ’)和与HIF有相互作用的识别序列(5，CTACGTGCT3)组成的双功能DNA序列为5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’。其次以这种双功能DNA为模板，于柠檬酸钠缓冲溶液中，利用NaBH4还原AgNO3的方法，成功合成了具有荧光的核酸纳米银簇(DNA-AgNCs )。这种核酸纳米银簇(DNA-AgNCs)在激发波长为510 nm下能发射585 nm的荧光，DNA-AgNCs的荧光量子产率为34.4% (以罗丹明B为参照)，纳米银簇的大小为~2 nm。其585 nm的荧光能被DNA的互补序列(AGCACGTAG)及HIF高表达的肿瘤细胞全蛋白淬灭，说明该核酸纳米银簇(DNA-AgNCs)是一种灵敏的荧光探针，可用于定性分析细胞全蛋白中HIF的含量，并可用于区分HIF高表达的肿瘤细胞和正常细胞。此荧光探针4°C环境中可保存大于4个月荧光未见明显变化。，按照下述步骤进行: 以5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3，序列为模板，在柠檬酸钠缓冲溶液中，加入由合成纳米银簇序列5’ CCTCCTTCCTCC3’和与HIF有相互作用的识别序列5’ CTACGTGCT3?组成双功能DNA，序列为5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’和AgN03混匀后放置到水浴中，20-68°C加热0.5-2 min,最佳lmin，后缓慢降温到室温1-2 h,最佳Ih ;加入NaBH4溶液将DNA-Ag+还原成DNA-Ag，转移到4°C环境中避光放置1-4天，最佳3天，即可得到稳定的荧光探针。其中所述的柠檬酸钠缓冲溶液的pH 5.0-6.0，浓度为10-20 mM，最佳条件pH5.0,浓度为 10 mM。其中所述的双功能DNA与Ag+的摩尔比为1:10 -1:20，最佳摩尔比为1:15。其中所述的NaBH4与Ag+的摩尔比:1:2- 4:1，最佳摩尔比:1:1。本专利技术利用HIF与特定核酸序列的特异结合，将这种微观结合信号放大为宏观荧光变化，来实现HIF的探测，是一种简便，直观的分析方法。【附图说明】: 图1为DNA-AgNCs的荧光激发和发射光谱图； 图2为DNA-AgNCs柠檬酸钠缓冲液中逐渐增加正常细胞全蛋白㈧，H印G-2细胞全蛋白⑶的荧光图。【具体实施方式】: 核酸纳米银簇(DNA-AgNCs)的合成 实施例1 (核酸纳米银簇(DNA-AgNCs)最佳制备方案):以5’CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3，序列为樽板，在3 mL柠檬酸钠缓冲溶液(pH 5.0，10 mM)中，加入 400 umol 的双功能 DNA (DNA 的序列是“5，CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’ ”)(序列由我们自己设计，用上海生物生工公司DNA合成仪合成，经过HPLC纯化，质谱验证序列为5’CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’ )和 6mmol AgNO3 (其中 DNA 与 Ag+ 的摩尔比为 1:15 )混匀后放置到水浴中，68°C加热稳定I min后，开始降温，经过2h后，降为室温。在稳定于室温的反应液中加入NaBH4溶液(其中NaBH4与Ag+的摩尔比2:1)，于室温静止放置15 min，将DNA-Ag+还原成DNA-Ag，将反应液转移到4°C环境中避光放置3天，即可得到稳定的荧光探针溶液5mL。以激发510 nm获得波长585 nm的荧光，荧光量子产率为34.4% (以罗丹明B为参照)。纳米粒径2 nm。实施例2:以5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3，序列为樽板，在3 mL柠檬酸钠缓冲溶液(pH 5.4, 10 mM)中，加入400umol的模板DNA和8 mmol AgNO3 (其中DNA与Ag+的摩尔比为1:20 )混匀后放置到水浴中，68°C加热稳定0.5 min后，开始降温，经过Ih后，降为室温。在稳定于室温的反应液中加入NaBH4溶液(其中NaBH4与Ag+的摩本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种核酸序列5’?CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’，?其特征为：?由合成纳米银簇序列（5’CCTCCTTCCTCC3’）和与HIF有相互作用的识别序列（5’CTACGTGCT3）组成双功能核酸（DNA），?质谱验证序列为5’?CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’。
【技术特征摘要】
1.一种核酸序列5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’,其特征为:由合成纳米银簇序列(5’ CCTCCTTCCTCC3’ )和与HIF有相互作用的识别序列(5’ CTACGTGCT3)组成双功能核酸(DNA),质谱验证序列为 5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’。2.一种用于检测缺氧诱导因子的荧光纳米核酸银的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行: 以5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3，序列为模板，在柠檬酸钠缓冲溶液中，加入由合成纳米银簇序列5’ CCTCCTTCCTCC3’和与HIF有相互作用的识别序列5’ CTACGTGCT3组成双功能DNA，序列为5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’和AgN03混匀后放置到水浴中，20-68°C加热0.5-2 min,最佳lmin，后缓慢降温到室温1-2 h,最佳Ih ;加入NaBH4溶液将DNA-Ag+还原成DNA-Ag，转移到4°C环境中避光放置1-4天，最佳3天，即可得到稳定的荧光探针。3.根据权利要求2所述的一种用于检测缺氧诱导因子...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈秋云，赵婷婷，杨欢，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：
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