本发明专利技术公开了一种具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的构建，属于酶工程领域。通过把酿酒酵母TDH3启动子序列、酿酒酵母分泌信号肽编码序列、黑曲霉纤维素外切酶编码序列、酿酒酵母凝聚因子C端的400个氨基酸片段编码序列、酿酒酵母TDH3终止子序列按顺序合成，在两端加上限制性内切酶位点，通过酶切构建到pPIC9K质粒中，再将该质粒转化到酵母中得到具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株。其生产纤维素外切酶的回收率达到86%，发酵后外切酶的酶活达到1.5U/g湿酵母。本发明专利技术实现了纤维素外切酶生产和同步浓缩回收的一步完成，降低了能源消耗，降低了成本，具有较强的实用性。
【技术实现步骤摘要】
一种具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的构建
本专利技术属于酶工程领域，具体涉及一种具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的构建。
技术介绍
纤维素是地球上最丰富的可再生资源，地球上每年因光合作用产生的纤维素达到 100亿吨左右，利用纤维素生产生物能源，是缓解能源危机，实现人类可持续发展的关键。纤维素利用的关键是把纤维素降解为可发酵性的糖类-葡萄糖。纤维素的降解需要外切酶、内切酶、葡聚糖苷酶的共同作用。其中外切酶降解晶体结构的纤维素，是纤维素降解的限速步骤。用纤维素酶降解纤维素具有绿色、条件温和、转化率高的特点，但是纤维素较高的生产成本成为纤维素酶降解纤维素的瓶颈。液体发酵具有发酵体积大，易实现自动化控制等特点，被广泛用来生产纤维素外切酶等。但是液体发酵生产的酶类产品浓度低的特征。生产的纤维素外切酶等都游离在发酵醪液中，为得到高浓度的纤维素外切酶或外切酶的固体粉末，需要对发酵醪液进行浓缩。 为纯化浓缩纤维素外切酶往往需要通过真空蒸发或喷雾干燥等工艺来浓缩。在纤维素蒸发浓缩或喷雾干燥的过程中，纤维素外切酶的活性丧失一部分，而且浓缩工艺大幅度提高了纤维素酶的生产成本。在蒸发或喷雾干燥的过程中，消耗大量的能源如电或燃气等。因此浓缩成本，成为降低液体发酵生产纤维素外切酶生产成本的必然选择。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株。本专利技术的另一目的在于提供用于构建上述酵母菌株的DNA片段。本专利技术的再一目的在于提供用于构建上述酵母菌株的质粒。本专利技术的目的还在于提供上述酵母菌株的构建方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现:用于构建具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的DNA片段，包括按顺序排列的酿酒酵母TDH3启动子序列、酿酒酵母分泌信号肽编码序列、黑曲霉纤维素外切酶编码序列、酿酒酵母凝聚因子C端的400个氨基酸片段编码序列、酿酒酵母TDH3终止子序列； 上述序列分别如SEQ ID N0.1~5所示。优选的，所述的用于构建具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的 DNA片段的序列如SEQ ID N0.6所示。用于构建具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的质粒为包含上述DNA片段的真核表达质粒。所述的真核表达质粒优选为PPIC9K质粒。所述的用于构建具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的质粒通过包含如下步骤的方法制备得到:合成两端有限制性内切酶识别位点含有上述DNA片段的序列，通过限制性内切酶连接到真核表达质粒上。所述的真核表达质粒pPIC9K质粒时，限制性内切酶优选为Bgl II和FspA I。一种具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株，含有上述质粒。所述的酵母菌株优选为酵母菌株SMDl 168。所述的具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的构建方法，包括如下步骤:制备酵母电转化感受态细胞，将上述质粒通过电转化转进酵母中得到。本专利技术相对于现有技术具有如下优点和效果:本专利技术的酵母菌株能在生产纤维素外切酶的同时，把纤维素外切酶吸收在菌株自身表面，通过简单过滤，就能达到浓缩纤维素外切酶的目的。本专利技术大大简化了纤维素外切酶的浓缩工艺，降低了能源消耗，大幅度降低了成本，因此该专利技术具有较强的实用性。本专利技术把黑曲霉(AspergiJJtts纤维外切酶基因在酵母内表达,并实现了烟曲霉外切酶生产和同步浓缩回收的一步 完成，现有技术未有相关报道，具有较高的创新型。本专利技术酵母菌株生产纤维素外切酶的回收率达到88%，发酵后外切酶的酶活达到 1.5 U/g湿酵母。【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术做进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1(l)pPIC9K质粒的提取I)接1%含PPIC9K质粒的大肠杆菌细胞于2 mL LB培养基。2)37°C振荡培养 12 h。3)取1.5 mL菌液于EP管，以4000 rpm离心3 min,弃上清液。4)加 0.1 mL 溶液 I (1% 葡萄糖，50 mM EDTA pH 8.0,25 mM Tris-HCl pH 8.0)充分混合。5)加入0.2 mL溶液II (0.2 mM NaOH, 1% SDS),轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min。6)加入0.15 mL预冷溶液111(5 mol/L KAc, pH4.8),轻轻翻转混匀,冰浴5 min。7)以10000 rpm离心20 min，取上清液于另一新EP管中。8)加入等体积的异戊醇，混匀后静置10 min。9)再以 10000 rpm 离心 20 min,弃上清。10)用70%乙醇0.5 mL洗涤一次,抽干所有液体。11)待沉淀干燥后，溶于0.05 mL TE缓冲液中。(2)大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备I)将大肠杆菌DH5a置于LB或其它营养丰富的培养基上，在37 °C下过夜培养。2)高温灭菌大的离心瓶(250~500 mL)以备第二天摇瓶用。3)准备几瓶灭菌水(总量约1.5升)，保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用。4)转移0.2~I mL过夜培养物至装有20 mL LB (或其他营养丰富的培养基)的 100 mL摇瓶。5)37 1:下剧烈振荡培养6小时。6)监控0D600值(培养I小时后每半小时测定一次)。7)当0D600值达到0.5~1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却15分钟。8)细胞在4 0C 5000g下离心15分钟，弃上清液。9)用灭菌的冰水重悬浮细胞，先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升)，然后加水稀释至离心管的2/3体积。10)照上面步骤重复离心，小心弃去上清液。11)照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞。12)离心，弃上清液。13)用20 mL灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞。14)照上面步骤离心，小心弃去上清液(沉淀可能会很松散)。15)用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2~3 mL。·16)将细胞按150 UL等份装入微量离心管，于-80 °C保存。(3)pPIC9K_CHB 质粒构建I)用限制性内切酶Bgl I1、FspA I分别酶切质粒pPIC9K。限制性内切酶Bgl I1、FspA I (TAkaRA)各 1.5 ML，提取的 pPIC9K 质粒溶液 6 IOXK Buffer I ML 加入到 100 ML EP 管中，在30 °C水浴锅中酶切60 min。再通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切的质粒pPIC9K。2)序列合成合成两端具有Bgl II和FspA I识别序列的序列GGAGATCTTCTAGACC-酿酒酵母TDH3启动子序列-酿酒酵母分泌信号肽编码序列-黑曲霉纤维素外切酶编码序列-酿酒酵母凝聚因子C端的400个氨基酸片段编码序列-酿酒酵母TDH3终止子序列-GGTGCGCACCC， 各片段及全长片段如SEQ ID N0.1~6所示。3)连接合成的碱基序列 20 ML，酶切的 pPIC9K 质粒 5 ML，IOXbuffer 5 ML，ddH20 10ML，T4 DNA连接酶(Takara) 5 ML加入100 ML EP管中，16 °C连接过夜。4)将上述连接产本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于构建具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的DNA片段，其特征在于：包括按顺序排列的酿酒酵母TDH3启动子序列、酿酒酵母分泌信号肽编码序列、黑曲霉纤维素外切酶编码序列、酿酒酵母凝聚因子C端的400个氨基酸片段编码序列、酿酒酵母TDH3终止子序列。
【技术特征摘要】
1.用于构建具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的DNA片段，其特征在于:包括按顺序排列的酿酒酵母TDH3启动子序列、酿酒酵母分泌信号肽编码序列、黑曲霉纤维素外切酶编码序列、酿酒酵母凝聚因子C端的400个氨基酸片段编码序列、酿酒酵母 TDH3终止子序列。2.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于:所述的序列分别如SEQID N0.1~5 所示。3.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于:所述的DNA片段的序列如SEQID N0.6所示。4.用于构建具有生产和回收纤维素外切酶双重功能的酵母菌株的质粒，其特征在于: 为包含权利要求1-3任一项所述的DNA片段的真核表达质粒。5.根据权利要求4所述的质粒,其特征在于:所述的真核表达质粒为pPIC9K...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛栋升，汪江波，蔡凤娇，曹敬华，陈茂彬，方尚玲，镇达，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：
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