限制性内切酶和核酸外切酶Ⅲ的无标记荧光检测DNA甲基化和甲基转移酶活性的检测方法技术

本发明专利技术公开一种基于限制性内切酶HpaⅡ和核酸外切酶Ⅲ的DNA甲基化及甲基化转移酶活性的检测方法。制备了无标记的DNA探针，该探针序列包含了限制性内切酶的切割位点和甲基化的CpG位点,通过该无标记的DNA探针与目标DNA杂交，用甲基化转移酶进行甲基化处理，再用限制性内切酶HpaⅡ的特异性切割以及作用于双链DNA的3'→5'外切酶活性的核酸外切酶Ⅲ作用，然后利用荧光信号分子噻唑橙对单双链DNA不同信号实现检测甲基化及甲基转移酶活性的目的。本发明专利技术无需制备复杂材料和标记DNA探针，可避免材料制备及标记DNA探针而导致检测成本高、操作烦琐，重现性差的缺陷。本发明专利技术具有成本低、快速、简便、灵敏度高的优点。

【技术实现步骤摘要】
限制性内切酶和核酸外切酶III的无标记荧光检测DNA甲基化和甲基转移酶活性的检测方法
本专利技术属于生物检测领域，具体涉及限制性内切酶和核酸外切酶III的无标记荧光检测DNA甲基化和甲基转移酶活性的检测方法，本专利技术属于一种识别特殊甲基化位点和定量分析DNA甲基转移酶活性的生物传感技术，具体是指DNA甲基化后，被甲基化敏感的限制性内切酶识别并切割特定的序列后，核酸外切酶III消化DNA，观测荧光信号分子噻唑橙信号的改变。
技术介绍
DNA甲基化是一种重要的修饰途径，在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶，这常见于基因的5’-CG-3’序列(被称为CpG岛)。大量研究表明，DNA甲基化涉及到调控许多细胞过程，比如胚胎发育、转录、染色质结构、X染色体失活、基因组印迹和染色体的稳定性。在高等真核生物的正常细胞中，一般情况下CpG岛是未甲基化，但是，异常甲基化会抑制遗传信息的表达，会导致人类各种疾病比如癌症。因此，DNA甲基化可以作为疾病的一种潜在生物标志。然而，要了解DNA甲基化CpG机制，我们需要一个可以识别甲基化的DNA特定本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于限制性内切酶和核酸外切酶Ⅲ无标记荧光检测DNA甲基化和甲基转移酶活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)无标记的探针DNA和目标DNA的选取：所述无标记的探针DNA和目标DNA部分互补，并且都包含一段能被限制性内切酶识别并切割的5'‑CCGG‑3'特定序列，并且3'尾部分别都多出6个碱基序列；(2)无标记的探针DNA与目标DNA的杂交；(3)甲基化转移酶对双链DNA上CpG位点进行甲基化；(4)对甲基化敏感的限制性内切酶HpaⅡ和核酸外切酶ⅢExoⅢ同时作用DNA；(5)加入荧光信号分子；(6)利用荧光分光度计对产物溶液进行检测。

【技术特征摘要】
1.一种基于限制性内切酶和核酸外切酶III无标记荧光检测DNA甲基化和甲基转移酶活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)无标记的探针DNA和目标DNA的选取:所述无标记的探针DNA和目标DNA部分互补，并且都包含一段能被限制性内切酶识别并切割的5’-CCGG-3’特定序列，并且3’尾部分别都多出6个碱基序列； (2)无标记的探针DNA与目标DNA的杂交； (3)甲基化转移酶对双链DNA上CpG位点进行甲基化； (4)对甲基化敏感的限制性内切酶HpaII和核酸外切酶III Exo III同时作用DNA ； (5)加入突光信号分子； (6)利用荧光分光度计对产物溶液进行检测。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述荧光信号分子为噻唑橙。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法的具体步骤如下:取无标记的探针DNA和目标DNA以及缓冲溶液于离心管中杂交，然后加入甲基转移酶使其CpG位点上的胞嘧啶甲基化，37°C反应I小时后，加入限制性内切酶Hpa II和核酸外切酶III Exo III，37V反应2.5小时，最...

【专利技术属性】
技术研发人员：卫伟，高春燕，刘松琴，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32