本发明专利技术公开了一种基于核酸外切酶Ⅲ末端保护分析检测小分子与结合蛋白相互作用的荧光生物传感技术，它包括末端有机小分子修饰的寡核苷酸ＤＮＡ链与蛋白的相互作用及核酸外切酶Ⅲ保护分析和基于双链指示染料进行末端保护的双链结构寡核苷酸ＤＮＡ链的荧光定量检测。本发明专利技术利用寡核苷酸ＤＮＡ链３’末端修饰的小分子和其结合蛋白或抗体的特异性结合，基于核酸外切酶Ⅲ末端保护作用，通过被保护的寡核苷酸ＤＮＡ链与双链嵌合染料的复合物的荧光进行小分子与蛋白相互作用以及小分子或其结合蛋白的检测。该方法操作简便、经济快速、灵敏、特异性强，可望成为食品与农产品安全检测、环境毒物检测、药物筛选等的通用技术。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于一种检测有机小分子与结合蛋白相互作用的生物传感技术，包括末端有机 小分子修饰的寡核苷酸DNA链与蛋白的相互作用及核酸外切酶III保护分析和基于双链指 示染料进行末端保护的双链结构寡核苷酸DNA链的荧光定量检测。
技术介绍
有机小分子与结合蛋白相互作用、药物与化学毒素等有机小分子以及小分子结合蛋白的快速筛查与检测对于临床诊断、医学研究、食品与公共安全、药物筛选、环境监测等领域具有极其重要的意义。目前常用的有机小分子与结合蛋白相互作用的检测技术主要有表面等离子共振、酶互补片断免疫分析以及荧光各向异性分析等。这些检测技术需要复杂的操作，精密的仪器，成本较高。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，针对现有技术存在的不足，提出一种基于核酸外切酶m末端保护分析检测小分子与结合蛋白相互作用的荧光生物传感技术，它对DNA序列没有依 赖性，可以检测小分子与蛋白的结合作用，也可检测结合蛋白，或通过竞争反应检测小分 子，并且操作简便、快速、灵敏。本专利技术的技术方案是，所述基于核酸外切酶III末端保护分析检测小分子与结合蛋白相 互作用的荧光生物传感技术包括(1)末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA链与蛋白的相互作用及核酸外切酶III 保护分析；(2)基于双链指示染料进行末端保护的双链结构寡核苷酸DNA链的荧光定量检测。 以下对本专利技术做出进一步说明。所述末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA链与蛋白的相互作用的检测及核酸外切酶 III保护分析采用以下步骤实现对于小分子与其结合蛋白的相互作用的检测的步骤是取所述小分子修饰双链结构DNA寡核苷酸链的储备液置于微量管中；然后加入包含小分子结合蛋白的样品溶液；再加 入核酸外切酶HI反应；对于有机小分子的检测，釆用竞争反应检测的步骤是取所述小分子修饰双链结构DNA寡核苷酸链的储备液置于微量管中；然后加入包含待测小分子的样品溶液，混合均匀后加入一定浓度的小分子的结合蛋白或(鼠源)单克隆抗体溶液；再加入核酸外切酶ni反应。所述末端保护的双链结构寡核苷酸DNA链的定量检测可采用标准的双链荧光嵌入染料 指示剂法进行检测。本专利技术中，所述双链结构寡核苷酸DNA的末端有机小分子的修饰通过现有的交联反应 技术实现。例如，对于带有羧基的有机小分子，可以采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺与琥珀酰亚胺交联反应技术与3'端NH2标记的包含血红素核酸适体的寡核苷酸DNA 单链进行交联；对于带氨基的有机小分子，可以采用4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己垸-l-羧 酸琥珀酰亚胺酯的交联反应技术与与3，端标记有巯基的包含血红素核酸适体的寡核苷酸 DNA单链进行交联。交联反应产物可用透析纯化。进一步地，本专利技术中，所述末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA链与蛋白的相互作用 的检测及核酸外切酶III保护分析采用以下步骤实现a. 对于小分子与其结合蛋白的相互作用的检测的步骤是取5 u 1所述小分子修饰双链 结构DNA寡核苷酸链的储备液置于微量管中，加入1.5wl IOX核酸外切酶III反应缓冲溶 液，该溶液为10 mM Bis Propane-HCL, pH 7.0, 10mM MgCL， lmM DTT);然后加入8 u 1包 含小分子结合蛋白的样品溶液，在37'C恒温反应0.5小时；再加入10U核酸外切酶III，置 于37'C反应5分钟后，升温至8(TC反应20分钟进行热灭活以终止酶反应；b. 对于有机小分子的检测，采用竞争反应检测的步骤是取5iU所述小分子修饰双链结 构DNA寡核苷酸链的储备液置于微量管中，加入1.5 lU 10X核酸外切酶III反应缓冲溶液， 该溶液为10 mM Bis Propane-HCL, pH 7.0， lOmM MgCL， lmM DTT);然后加入5 u 1包含待 测小分子的样品溶液，混合均匀后加入一定浓度的小分子的结合蛋白或(鼠源)单克隆抗体 溶液3ul，单克隆抗体终浓度为加入的小分子修饰寡核苷酸DNA链浓度的5倍；在37'C恒 温反应0.5小时，再加入IOU核酸外切酶III，置于37"反应5分钟后，升温至80'C反应 20分钟进行热灭活以终止酶反应。注意，以上反应条件为最优条件，所述溶液体积均可成倍变化不改变最优结果。改变比 例或试剂加入顺序可使有机小分子修饰寡核苷酸DNA单链的保护效率在1 % 100%内变化。本专利技术中，所述末端保护的双链结构寡核苷酸DNA链的定量检测可采用标准的双链荧 光指示剂法进行，以下是用双链荧光嵌入染料SYBR-GREEN 1指示剂法对末端保护的发夹 型寡核苷酸DNA链的定量检测步骤在所述保护反应溶液中，加入5 u 1 SYBR-GREEN 1 (—种双链荧光嵌入染料，1 : 30000稀释)，用核酸外切酶反应缓冲液稀释到lOOul，放入荧光光谱仪，以480nm为激发波长、 520nrn为发射波长测其荧光信强度。本专利技术提出了一种基于双链结构的DNA寡核苷酸末端保护分析的方法，此方法对DNA 序列没有依赖性，仅需设计一条发夹形的寡核苷酸探针或设计一对互补双链，在其3'端进行 小分子标记，即可实现检测；它也可直接用于小分子结合蛋白的检测，还可通过样品溶液中 小分子与小分子标记的寡核苷酸DNA链竞争与抗体结合间接检测有机小分子，其操作快速 简便、灵敏特异，可望为临床诊断、药物研发、药毒物分析、环境监测等提供一个通用技术 平台。具体实施例方式实施例l:基于核酸外切酶末端保护分析检测赭曲霉素A 1) 3'端NH2标记的寡核苷酸DNA链和赭曲霉素A的交联称取9.3mg的赭曲霉素A溶于2.5mL磷酸盐缓冲溶液(0.1 MNaH2P04， pH 7.4)，再加 入lmg的l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)，在室温下搅拌15min，再加入2.8mg 琥珀酰亚胺(NHS)，在室温反应30分钟；取260!il活化后的赭曲霉素A溶液加入到260y l浓度为1 u M的3'端NH2标记的发夹型寡核苷酸DNA链(序列为5'-GAATTC CAAGCG CGA AGT TTT CTT CGC GCT TGG AAT TC-3，)的溶液中，用1M的NaOH调其pH为7.4， 在轻微搅拌下室温反应2小时；反应后在混合液中加入3.6mg盐酸羟胺终止反应。把交联反应产物移到lmL的透析管中，透析管的截留分子量为6000D。把透析管放入 500ml磷酸盐缓冲溶液(0.1 MNaH2P04， pH 7.4)中在4'C透析12小时，每隔3小时更换 一次透析液，最后一次用超纯水透析。透析之后的寡核苷酸DNA链分管保存于-2(TC的冰箱 中备用。上述的-20'C保存的寡核苷酸DNA链用灭菌水稀释10倍并保存于4'C冰箱中作为 次级储备液备用。2)赭曲霉素A的检测取上述赭曲霉素A标记的寡核苷酸DNA单链次级储备液于微量管中,终浓度为100nM， 加入5 y 1 SYBR-GREEN 1 (—种双链荧光嵌入染料，1 : 30000稀释)和1.5ul的IOX核酸 外切酶III反应缓冲溶液(10 mM Bis Propane-HCL, pH 7.0,10mM MgCL2, ImM DTT)，再加 入5iil待检测的赭曲霉素A样品溶液，混合均匀后加入3ul浓度为lOO本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于核酸外切酶Ⅲ末端保护分析检测小分子与结合蛋白相互作用的荧光生物传感技术，其特征是，该技术包括： （１）末端有机小分子修饰的寡核苷酸ＤＮＡ链与蛋白的相互作用及核酸外切酶Ⅲ保护分析； （２）基于双链指示染料进行末端保护的双链 结构寡核苷酸ＤＮＡ链的荧光定量检测。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋健晖，吴战，楚霞，沈国励，俞汝勤，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]
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