核酸外切酶Ⅲ消化FRET-dsDNA微阵列芯片检测转录因子蛋白制造技术

转录因子是一类负责基因表达调控的重要蛋白质，是基因表达调控通路及网络的枢纽，是功能基因组和蛋白质组研究的重要对象，也是转录治疗和药物研究的重要靶点。本发明专利技术提出了一种检测转录因子表达和活化水平的新方法“核酸外切酶Ⅲ消化ＦＲＥＴ－ｄｓＤＮＡ微阵列芯片检测转录因子蛋白”。运用该方法分析转录因子表达和活化水平包括如下步骤：（ａ）准备ＦＲＥＴ－ｄｓＤＮＡ微阵列芯片；（ｂ）转录因子蛋白与ＦＲＥＴ－ｄｓＤＮＡ微阵列芯片反应；（ｃ）核酸外切酶Ⅲ与ＦＲＥＴ－ｄｓＤＮＡ微阵列芯片反应；（ｄ）ＦＲＥＴ－ｄｓＤＮＡ微阵列芯片荧光检测分析。

【技术实现步骤摘要】

转录因子(transcription factor)是生物蛋白质组(proteomics)中一类负责基因表达调控(geneexpression regulation)的重要蛋白质，是基因表达调控通路(pathway)及网络(network)的枢纽，是功能基因组(functional genomics)和蛋白质组研究的重要对象；许多疾病都与转录因子的异常表达(expression)及活化(activation)存在密切的关系，成为转录治疗(transcriptional therapy)和药物研究的重要靶点(drug target)。转录因子表达及活化程度的检测分析是研究其功能的主要手段。本专利提出了一种检测转录因子表达和活化水平的新方法，该方法将为是分子生物学(molecular biology)、功能基因组学、蛋白质组学及生物医学(Biomedicine)领域中的转录因子相关研究提供一种新的检测分析技术，可促进这些领域中转录因子相关的科学研究，以及在生物医学领域中提供一种疾病相关转录因子的诊断技术、以及转录因子为靶点的药物筛选(drug screening)技术。
技术介绍
转录因子蛋白是生物蛋白质组中一类负责基因表达调控的重要蛋白质，是基因表达调控通路及网络的枢纽，是功能基因组和蛋白质组研究的重要对象；许多疾病都与转录因子的异常表达及活化存在密切的关系，成为转录治疗和药物研究的重要靶点。转录因子表达及活化程度的检测分析是研究其功能的主要手段。因此，有关检测分析转录因子表达及活化程度技术的研究一直受到科学界的重视。分子生物学研究表明，在基因的上下文(context)存在一些发挥启动(promote)、增强(enhance)或衰减(attenuate)基因转录作用的特定DNA序列，称为顺式作用元件(cis-actingelements)，如启动子(promoter)、增强子(enhancer)、衰减子(attenuater)；转录因子蛋白是生物蛋白质组中一类特殊的蛋白质，这类蛋白质的细胞质中完成其翻译(translation)后，在正常细胞功能状态或细胞受到特定因子诱导下，进入细胞核，与基因组中的顺式作用元件发生特异性识别结合，组成基因转录机器(transcription apparatus)，实现其基因表达的调控功能，称为反式作用因子(trans-acting factors)。转录因子蛋白与顺式作用元件组成基因转录机器的首要环节是转录因子蛋白中一些具有特殊结构转录因子直接与顺式作用元件DNA序列发生序列特异性结合(sequence-specific binding)，完成基因转录机器组装的第一步。因此，检测分析转录因子表达及活化程度的技术主要建立在DNA/蛋白质相互作用这一层次，即运用含有顺式作用元件的DNA为探针，探测转录因子的表达及活化。时至目前，科学家们已经建立多种基于DNA/蛋白质相互作用这一层次的转录因子表达及活化程度的检测分析技术。其中最经典的是电泳迁移率变动分析(Electrophoresis MobilityShift Assay)，即凝胶迁移实验(gel shift assay)。该技术一般是人工合成含有转录因子结合序列(consensus，binding sites)的双链(double-stranded)寡核苷酸(oligonucleotides)，并用放射性同位素标记寡核苷酸，将标记寡核苷酸与含有转录因子蛋白的细胞或组织抽提物混合孵育一段时间后，进行自然聚丙烯酰胺凝胶电泳(native polyacrylamide gel eletrophoresis，PAGE)，分离游离(free DNA)和与蛋白质结合的DNA(retarded DNA)，在通过X-光底片暴光显现与蛋白质结合的DNA(retarded DNA)，来反映转录因子表达及活化程度。这一技术目前仍非常有效地用于转录因子蛋白检测分析。但存在放射性标记对实验人员及环境危害的缺陷。因此，对这一技术后来进行了非放射性标记的改进。即用地高辛(digoxigenin，DIG)标记寡核苷酸，进行自然聚丙烯酰胺凝胶电泳，再将电泳产物转印(blotting)到尼龙膜(nylon membrane)等介质上，依靠碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶耦联的DIG抗体和相应酶的生色(colorimetric)或发光(chemiluminescent)底物(substrate)，进行化学生色或发光检测，来反映转录因子表达及活化程度。也有采用荧光(fluorescent)标记寡核苷酸进行电泳迁移率变动分析的改进技术。这些技术也能够很好地用于转录因子蛋白检测分析。但这些技术仍然存在自身的缺点，即它们虽然避免了经典放射性标记探针凝胶迁移实验的缺点，但同时带来实验流程的复杂化和更多的影响因素，如尼龙膜实验的高背景、转引设备需求及实验成本提高等问题。同时，这些改进技术从根本上未摆脱种凝胶迁移实验的技术思想，无法克服凝胶迁移实验对实验样品数量需求大、实验耗时长、分析效率低等缺陷。鉴于这些技术目前仍然存在的缺点，建立从技术思想角度上完全不同于凝胶迁移实验的转录因子表达及活化检测及分析技术是非常必要的。为此我们已经进行了诸多相关研究，并发展了一些新的技术。例如，利用基因芯片技术的策略，我们曾经致力于将含有转录因子蛋白结合位点的双链DNA固定到固相载体如玻片表面，制备双链DNA微阵列芯片(double-stranded DNA microarray chip)，用于转录因子表达及活化的检测及分析。我们专利技术了数种制备双链DNA微阵列芯片的技术(中国专利ZL02112780.8，02137945.9，03152881.3)，并成功制备了专用于检测转录因子蛋白NF-κB的双链DNA微阵列芯片(中国专利03132206.9)，而且由此建立了一种在“DNA/蛋白质”相互作用的分子层面上从复杂组分物质如中药和组合化学混合物中高通量筛选、捕获和分离目标分子的技术(中国专利03152882.1)。技术的有效性和实用性是技术的命脉。虽然我们的双链DNA(dsDNA)微阵列芯片技术已经达到了实用化水平，但我们注意到该项技术的推广应用仍然面临很大的困难，具体反映在以下几点一是我们以前的方法制备的双链DNA微阵列芯片很难实现同时检测多转录因子，达不到高通量检测的目的；二是在检测中需要制备待检测转录因子蛋白的抗体；三是需要进行蛋白的荧光标记。这些缺点使我们必须制备各种双链DNA微阵列芯片，来实现对多种转录因子的检测，这并不能实现DNA微阵列芯片可高通量获取生物信息的功能，另外抗体的制备和标记是一种费时费力费钱的工作，极大地限制了芯片的应用，增加的实验的复杂性和难度，提高了实验成本。因此，建立一种不依赖于抗体制备及标记，并且可真正实现多转录因子高通量检测的dsDNA微阵列芯片技术是非常需要的。由此，我们着力改进这一技术，将DNA微阵列芯片技术、荧光共振能量传递(fluorescence resonance energy transfer，FRET)技术及核酸外切酶III保护分析(ExoIII Protection Assay)技术结合在一起，提出了本专利技术“核酸外切酶III本文档来自技高网...

【技术保护点】
核酸外切酶Ⅲ消化ＦＲＥＴ－ｄｓＤＮＡ微阵列芯片检测转录因子蛋白，提出了一种检测转录因子新方法，其特征在于运用该方法检测转录因子蛋白表达和活化水平包括如下步骤：ａ）准备ＦＲＥＴ－ｄｓＤＮＡ微阵列芯片；ｂ）转录因子蛋白与ＦＲＥＴ －ｄｓＤＮＡ微阵列芯片反应；ｃ）核酸外切酶Ⅲ与ＦＲＥＴ－ｄｓＤＮＡ微阵列芯片反应；ｄ）ＦＲＥＴ－ｄｓＤＮＡ微阵列芯片荧光检测分析。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王进科，
申请(专利权)人：王进科，南京新益华集团有限公司，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]