寡聚核苷酸嵌入染料荧光共振能量传递分子检测方法技术

本发明专利技术将荧光共振能量传递（ＦＲＥＴ）的技术引入到蛋白质芯片的制备和检测中。通过设计，使特异嵌入寡聚核苷酸双链而发光的染料分子，与目标分子上标记的荧光分子形成ＦＲＥＴ的给体和受体。通过引入ＦＲＥＴ，大大提高了蛋白芯片的特异性，是先识别后固定方法的延续和发展。本发明专利技术的一个目的是，提供一种基于荧光共振能量传递的蛋白质芯片，根据本发明专利技术的蛋白质芯片包括芯片基底和固化在其上的发卡形寡聚核苷酸，复合探针分子包括蛋白质以及与其相连的寡聚核苷酸，荧光标记的目标蛋白分子，和特异嵌入寡聚核苷酸双链而发光的染料分子。本发明专利技术的另一个目的在于，提供一种能够固定和检测蛋白质的方法。（*该技术在2024年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种。
技术介绍
随着后基因组和蛋白质组工作的开展，研究人员们迫切需要一种既高效又稳定的高通量蛋白分析技术。蛋白质芯片就是这样一种技术，它在基因芯片的基础上继承发展而来。蛋白质是由氨基酸长链盘绕折叠而成的一个三维的立体结构，通过这个立体结构蛋白质就可以实现与其它分子识别等复杂的功能。1994年，澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams首先提出蛋白质组(Proteome)的概念(见文献Alan Dove，Nature Biotechnology，17233(1999))。最初的定义为特定细胞在特定时间内所表达的所有蛋白质。关于蛋白质组的研究则称为蛋白质组学。为了研究成千上万的蛋白质的相互作用和运动规律，需要一种高通量、高灵敏度的分析方法。基因芯片已经提供了一个高通量、高灵敏度分析基因序列的成功范例。尤其是我们的两个专利申请(公开号分别为1373228和1477210)，使高灵敏度低成本的基因芯片成为可能。蛋白质芯片可以看成是基因芯片的延续和发展，成为生物芯片分析方法中一个非常重要的组成部分。蛋白质芯片的概念蛋白质芯片(Protein Chip)，又称为蛋白质微阵列(ProteinMicroarray)(参见文献MacBeath，G.and S.L.Schreiber，Science，2000.2891760(2000))。是20世纪90年代末提出的一个新概念，指将蛋白质分子以微阵列的形式固化在基底表面，利用蛋白质分子的识别特性来完成一定功能的集成装置。蛋白质芯片要素基底是蛋白质芯片的载体，它必须能够固定作为功能主体的蛋白质，并尽可能地保持其生物活性。基底还应具有适合某种检测手段的特性。现在普遍采用的基底有高分子(参见文献Zhang M.Q.et al.Biomaterials，19953(1998))、金(参见文献Smith A.M.et al.Biosensors& Bioelectronics，15183(2000))、玻璃(参见文献Boyle M.D.et al.Journal of Microbiological Methods，4687(2001))、半导体材料(参见文献Liao W et al.Sensors and Actuators，101361(2004))等。蛋白质是蛋白质芯片功能体现的主要承担者。也可以用蛋白质的集合体(细胞，病毒，细菌，组织等)或类似物(短肽片段，适体，锌指结构)来替代。功能显然，蛋白质芯片必须完成一定的功能，功能可以是合成，筛选，分离，检测或者它们的综合。蛋白质芯片特征蛋白质分子在基底上呈阵列排布，这样的排布有利于进行蛋白质的多种类、高通量、平行检测。固定在基底上和待测体系中的所需蛋白质的量都非常低，根据检测手段的不同一般可达到μg-ng量级，以适应小剂量、高灵敏度检测的要求。蛋白质芯片技术难点蛋白质探针制备如何获得大量高纯度的蛋白质探针分子，是蛋白质芯片制备的生物学瓶颈。通常的方法有两种一是生物技术方法，经过质粒转染，表达，分离，提纯等步骤，耗时耗力，只能进行少数蛋白的制备；二是利用化学多肽合成的方法，这种方法很难合成较大的蛋白，只适合于合成较短的多肽片段。蛋白质分子的高活性固定蛋白质分子在固体表面，很容易由于表面与蛋白相互作用而导致蛋白质分子变性和功能的损失。所以，如何保持固定后蛋白质分子的活性是蛋白质芯片制备的化学瓶颈。通常使用的固定方法有两类一类是直接固定的方法，将蛋白质分子通过物理吸附，化学键耦联等方法直接固定在固体基底表面，在这类方法中，蛋白质分子与基底直接接触，容易变性而失活(参见文献SmithA.M.et al.Biosensors & Bioelectronics，15183(2000))；第二类是间接固定的方法，即在蛋白质分子与基底之间再加上一层生物连接分子，以保持蛋白质分子的独立状态和活性，通常采用的方法是ProteinG-IgG，生物素-抗生素，DNA-寡核苷酸等特异相互作用分子对，这类方法需要额外的步骤，并且固定效率低(参见文献Baumann S.etal.Journal of Immunological Methods，22195(1998))。高灵敏度检测方法相对于传统的生物传感器，由于蛋白质芯片上蛋白质的量更少，所以要求检测装置有更高的灵敏度。最通常使用的是荧光标记激光扫描成像的方法。我们已申请的基因芯片相关专利1、发卡形探针基因芯片及其制备方法和检测方法申请号02116302.2公开号1373228公开日期2002-10-09该专利技术涉及一种基因芯片，包括芯片基底和固化在其上的寡聚核苷酸探针，探针包括探测区和茎杆区；茎杆区中的寡聚核苷酸序列和与其匹配的寡聚核苷酸序列形成发卡形双链结构，其核苷酸的匹配方式和碱基数目满足下列条件发卡形寡聚核苷酸探针的解链温度，在单点错配杂交状态的解链温度-5℃到完全匹配杂交状态的解链温度+5℃的范围之间。本专利技术可通过对该基因芯片进行电位控制进一步优化杂交条件。本专利技术基因芯片和样品都无须作任何标记，芯片可以重复使用，制作和使用成本大大降低，且具有识别完全匹配和单点错配的寡聚核苷酸序列的能力。可广泛应用于生物
2、基因芯片电位扫描无标记荧光检测方法申请号03142612公开号1477210公开日期2004-02-25该专利技术涉及一种基因芯片电位扫描无标记荧光检测方法，采用发卡形探针基因芯片，首先用标靶配制标准溶液，将标准溶液与探针杂交，并加入嵌入式荧光染料，对芯片基底施加电位和进行电位扫描，记录扫描下的探针与标准溶液杂交的荧光信号标准曲线；然后将待测样品DNA溶液装入荧光法测量芯片杂交的装置，与探针杂交，并加入嵌入式荧光染料；同样对芯片基底施加电位和进行电位扫描，记录扫描下的探针与待测样品杂交的荧光信号变化的曲线；将该曲线与标准曲线进行比较，给出识别结果。本专利技术可确切和可靠地实现单核苷酸多态性(SNP)的识别，探针和样品都无需进行特殊的标记，大大降低了成本。可广泛应用于生物芯片
蛋白质在固体表面容易由于疏水相互作用而导致其三维结构的破坏，从而导致其生物功能的丧失。所以，蛋白在固体表面的失活，是制约蛋白质芯片技术的一个重大瓶颈。我们从制备和检测思路上进行创新，专利技术了先识别后固定的新型蛋白质芯片，即探针蛋白与目标蛋白先在溶液中进行识别，然后通过耦联在探针蛋白上的寡聚核苷酸与芯片基底表面的寡聚核苷酸杂交，将识别后的复合物固定在芯片上的指定位置，这样就从根本上有效地解决了蛋白在表面失活的问题。这样的蛋白芯片又引入了一个新的问题，即寡聚核苷酸杂交特异性的问题。非特异性杂交将会给蛋白质芯片引入更大的误差。本专利技术可以有效地解决这一问题。
技术实现思路
在本专利技术中，我们将荧光共振能量传递(FRET)的技术引入到蛋白质芯片的制备和检测中。FRET是指激发态能量从初始激发的给体(donor)向受体(acceptor)的传递。(参见文献Joseph R.Lakowicz，Principles ofFluorescence Spectroscopy，Kluwer Academic/Plenum Publisher，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种寡聚核苷酸嵌入染料荧光共振能量传递分子检测方法，芯片基底有固化在其上的寡聚核苷酸，以及复合探针分子，其特征在于：　　　　芯片基底表面覆盖上一层末端为反应活性官能团的有机薄膜，通过共价键合，将一类序列已知的寡聚核苷酸固定在基底表面；　　　　将蛋白质与另一类序列已知的寡聚核苷酸相连做成复合探针分子；　　　　两类寡聚核苷酸序列中存在一段完全互补的序列；　　　　将目标蛋白分子进行荧光标记；　　　　在寡聚核苷酸双链中嵌入特异发光的染料分子，与目标分子上标记的荧光分子形成荧光共振能量传递的给体和受体；　　　　检测由于荧光共振能量传递产生的荧光信号。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵新生，廖玮，郭素，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]