具有削弱的3′-5′核酸外切酶活性的热稳定性的或热激活性的DNA聚合酶分子制造技术

本发明专利技术涉及带有削弱的３′－５′核酸外切酶（“校正”）活性的热稳定性或热激活性ＤＮＡ聚合酶，用于其合成的方法，其使用的方法，以及含有其的试剂盒。此酶在很多的重组ＤＮＡ技术特别是通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）的核酸扩增中是有用的。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及具有削弱的3’-5’核酸外切酶(“校正”)活性的热稳定性的或热激活性的DNA聚合酶，它们的合成方法，它们的应用方法，和包含它们的试剂盒。其是在许多重组DNA技术，特别是通过聚合酶链式反应(PCR)的核酸扩增中应用的酶。
技术介绍
DNA聚合酶以从5’到3’的方向用互补模板DNA链和引物从三磷酸脱氧核苷(核苷酸)在延长链的3’-羟基自由端顺序地增加核苷酸而合成DNA分子。模板链通过Watson-Crick碱基对确定核苷酸增加的顺序。在细胞中，在DNA修补合成和复制中涉及DNA聚合酶。参见，例如Komberg等.，1992，DNA合成，W.H.Freeman，纽约；Alberts等，1994，细胞分子生物学，第三版，Garland出版社，纽约。许多分子克隆技术和方案都包括由DNA聚合酶在体外反应催化而合成DNA。例如，DNA聚合酶被用于DNA标记和DNA测序反应，使用35S-，32P-，33P-或荧光标记核苷酸。聚合酶链式反应(PCR)技术是一种最通用的广泛使用的DNA合成技术，由美国专利No.4,683,202；4,683,195；4,800,159；和14,965,188公开，PCR策略，1995 Innis等(编著)，学院出版社，中有所讨论，它们全文在此引作参考。最有特点的DNA聚合酶是大肠杆菌(Escherichia coli)DNA聚合酶I(Eco PolI)。Eco Pol I和一些与其同源的DNA聚合酶具有三种酶的功能i) 5’-3’核酸外切酶活性，ii)3’-5’核酸外切酶活性，iii)DNA合成活性。后两种功能的克列诺片段(EcoPolIK)位于蛋白的羧基末端。可以用枯草杆菌蛋白酶处理EcoPolI的酶制剂，产生缺少5’-3’核酸外切酶活性的EcoPol IK。参见Brown等1982，生物化学杂志(JBiol.Chem.)，2571965-72；Joyce等，1982，生物化学杂志，2571958-64；Joyce等，1983，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)801830-34；Klenow等，1970，Pro.Natl.Acad.Sci.USA 65168-75；Komberg，1974；Setlow，P.等，1972，生物化学杂志，247224-31；Setlow等，1972，生物化学杂志，247232-40；Steitz等，1987，蛋白质工程，第20章，pp.227-35，Oxender等(编著).Alan R.Liss，纽约。Eco Pol I K的晶体结构分析显示为其肽链被折叠成完全不同的两个结构域，较小的区域有200个氨基酸残基，是3’-5’核酸外切酶区域，另一个区域有400个氨基酸残基，是DNA合成区域。参见Ollis等，1985，自然杂志(Nature)313762-66。3’-5’核酸外切酶活性位点和DNA合成的活性位点大约由30埃分开。参考上述文献。DNA合成活性位点与包含单链5’延申端的双链DNA和三磷酸脱氧核苷(dNTP)连接，而3’-5’核酸外切酶活性位点与单链DNA和单磷酸脱氧核苷(dNMP)连接。参见上述文献。由Bemat等预测大量DNA聚合酶中存在保守的3’-5’核酸外切酶活性位点，1989，细胞(Cell)59219-28；Blanco等，1992，基因(cell)112139-44；Reha-Krantz，1992，基因(Gene)112133-37。Eco Pol I的DNA合成区域被克隆，表达，并分别表征3’-5’和5’-3’核酸外切酶区域。如上述讨论一样，DNA合成区域包括大约400个氨基酸。在DNA合成区域聚合酶活性比Eco Pol I K中的小50倍。参见Derbyshire等，1993，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，215439-48。来自各种生物体的热稳定性的或热激活性DNA聚合酶已经在文献中被广泛公开了。详细的例子包括来自真菌Thermus的不同种的DNA聚合酶，参见美国专利No.5,466,591，特别是在美国专利No.4,889,818，5,352,600和5,079,352中描述的来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq DNA聚合酶)，来自真菌Thermatoga maritima(Tma DNA聚合酶)的DNA聚合酶在美国专利No.5,374,553和5,420,029中公开。嗜温的大肠杆菌和嗜热的T.maritima都是真菌。如大肠杆菌的DNA聚合酶I一样，Tma DNA聚合酶具有5’-3’的核酸外切酶活性和3’-5’的核酸外切酶活性。相反，来自Thermus的DNA聚合酶也是嗜热的真菌，但仅具有5’-3’核酸外切酶活性。热稳定和热活性DNA聚合酶和它们的相关活性的综述参见Abramson，1995，PCR策略(PCR Strategies)，Innis等(编著)，学院出版社，Inc。缺少3’-5’核酸外切酶活性的大量的原始的突变体形式，真菌热稳定或热活性DNA聚合酶在美国专利No.6,015,668，5,39,301，5,988,614，5,882,904，5,489,523中公开。虽然Eco Pol I和Tma DNA聚合酶具有同样的三种酶的活性，和相同的普通域的结构，但它们是非常不同的酶。例如，Eco Pol I和Tma DNA聚合酶具有完全不同的氨基酸序列。特别地，即使当间隙插入到它们的序列中使它们的排列最优化，这两种蛋白的3’-5’核酸外切酶功能域也仅有大约33％相同。而且，这两种酶表现出不同的特异活性和对化学变性条件的抗性不同。从它们的自然体内环境分离的纯化的酶中观察到这些区别，它们一定是酶本身的氨基酸序列的不同而导致的。初生态DNA链由3’-5’核酸外切酶活性“校正”合成，首先从中除去模板链中错配的核苷酸，从而增加了DNA合成的重现精度。然而，强3’-5’核酸外切酶活性的存在对体外的聚合反应特别是PCR是存在问题的，其中3’-5’核酸外切酶活性的存在降低扩增的效率。参见Bames，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA912216-20。为了避免3’-5’核酸外切酶活性的有害效应，有人曾尝试应用缺少3’-5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶。Taq聚合酶天然缺少这种活性。其它的DNA聚合酶已经通过基因工程将其消除。参见，如，美国专利No.6,015,668，5,939,301，5,988,614，5,882,904和5,489,523。在这些申请中的酶工作的高复制重现精度是不必须的，例如，在PCR中用于扩增DNA测序反应的模板，大小分析，限制性酶分析和以探针为基础的分析。然而，其它聚合反应，如，扩增用于克隆的一个DNA片段的PCR，需要较高的保真度水平。在保留3’-5’核酸外切酶活性的优点时又降低与其相关的问题的努力中，使用两种不同的DNA聚合酶的混合物。在混合物中的一种聚合酶具有野生型水平的3’-5’核酸外切酶活性。另一种缺少此活性。这两种聚合酶的比率可以调整为产生所期望的3’-5’核酸外切酶与DNA聚合酶活性的比率。参见Cheng等，1994，Proc.NatlAcad.Sci.USA91本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的含有一个３′－５′核酸外切酶区域并且通过标准试验测定显示出削弱的大约６．５或更低但大于０Ｕ／ｐｍｏｌ的３′－５′核酸外切酶活性的热稳定性或热激活性ＤＮＡ聚合酶，其中所述的３′－５′核酸外切酶区域含有选自下列序列基元的一个序列基元： （ａ）一个具有通式ＤＸ↓［１］ＥＸ↓［２］Ｘ↓［３］ＳＸ↓［４］的序列基元，其中 Ｄ为天冬氨酸残基， Ｘ↓［１］为任意氨基酸残基，或没有残基， Ｅ为谷氨酸残基， Ｘ↓［２］为任意氨基酸残基， Ｘ↓［３］为任意氨基酸残基， Ｓ为丝氨酸残基，和 Ｘ↓［４］为任意氨基酸残基， 或 （ｂ）一个具有通式Ｘ↓［５］Ｘ↓［６］Ｘ↓［７］Ｘ↓［８］Ｘ↓［９］Ｘ↓［１０］Ｘ↓［１１］Ｘ↓［１２］Ｘ↓［１３］Ｘ↓［１４］的序列基元（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１），其中： Ｘ↓［５］为任意氨基酸残基， Ｘ↓［６］为任意氨基酸残基， Ｘ↓［７］为半胱氨酸或亮氨酸残基， Ｘ↓［８］为任何氨基酸残基， Ｘ↓［９］为苯基丙氨酸或酪氨酸残基， Ｘ↓［１０］为任意氨基酸残基， Ｘ↓［１１］为任意氨基酸残基， Ｘ↓［１２］为任意氨基酸残基， Ｘ↓［１３］为异亮氨酸或缬氨酸残基，和 Ｘ↓［１４］为亮氨酸或苯丙氨酸残基，或 （ｃ）一个具有通式ＤＸ↓［１５］Ｘ↓［１６］Ｘ↓［１７］Ｘ↓［１８］Ｘ↓［１９］ＹＸ↓［２０］Ｘ↓［２１］Ｘ↓［２２］Ｘ↓［２３］的序列基元（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２），其中： Ｄ为天冬氨酸残基， Ｘ↓［１５］为脯氨酸，丙氨酸，亮氨酸或苏氨酸残基， Ｘ↓［１６］为亮氨酸或甲硫氨酸残基， Ｘ↓［１７］为亮氨酸或异亮氨酸残基， Ｘ↓［１８］为任意氨基酸残基， Ｘ↓［１９］为丙氨酸或丝氨酸残基， Ｙ为酪氨酸残基， Ｘ↓［２０］为亮氨酸残基，异亮氨酸残基或缬氨酸残基， Ｘ↓［２１］为亮氨酸残基或色氨酸残基， Ｘ↓［２２］为天冬氨酸残基，天冬酰胺残基，谷氨酸残基或谷氨酰胺残基，和 Ｘ↓［２３］为脯氨酸残基或丝氨酸残基，或 （ｄ）一个具有通式Ｘ↓［２４］Ｘ↓［２５］Ｘ↓［２６］Ｘ↓［２７］Ｘ↓［２８］Ｘ↓［２９］Ｘ↓［３０］Ｘ↓［３１］Ｘ↓［３２］Ｘ↓［３３］Ｘ↓［３４］Ｘ↓［３５］Ｘ↓［３６］的序列基元（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３），其中： Ｘ↓［２４］为脯氨酸或丙氨酸残基， Ｘ↓［２５］为任意氨基酸残基， Ｘ↓［２６］为谷氨酸，天冬氨酸或脯氨...

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：NJ舍恩布伦纳，TW迈尔斯，DH格尔弗兰德，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]