从混合物中分离感兴趣的寡核苷酸的方法技术

一种使用双相性流动相/固定相液-液色谱系统从混合物中分离寡核苷酸的方法。第一流动相含有寡核苷酸且固定相含有可去除地结合目标寡核苷酸的交换剂物质。使该流动相在液-液色谱仪中与该固定相流动接触以使该寡核苷酸在液体固定相中结合该交换剂物质。然后通过可将寡核苷酸从固定相置换入第二流动相的置换剂物质将该寡核苷酸从液体固定相置换入第二液体流动相。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及新方法，特别是使用无载体液-液色谱法分离寡核苷酸和化学杂质的方法。寡核苷酸包含相对短序列的核酸聚合物，其可为DNA或RNA，典型具有50个或更少的碱基，虽然现在可合成具有多至约200个碱基的寡核苷酸。寡核苷酸有用于治疗。被Prosensa公司以其名称PR0051和本申请名称GSK2402968确定的一种合成的RNA寡核苷酸具有序列5’ -uca agg aag aug gca uuu ca_3’。此寡核苷酸是一种反义寡核苷酸，即与所选序列互补的DNA或RNA单链。认为其诱导外显子(exon) 51的外显子遗漏，且在用于治疗具有杜氏肌肉营养不良(DMD)的非卧床男孩的III期临床研究中。此类寡核苷酸的一个问题是其从杂质的纯化。例如上述GSK2402968是20_mer，且在其合成中其可受到杂质污染，包括含有更短链或更长链，例如含有17、18、19和21个碱基的其它寡核苷酸。还可能存在其它杂质。希望提供有效并可应用于工业生产规模的用于分离此类寡核苷酸的方法。“Therapeutic oligonucleotides:The state of the art in purification technologies，，，Sanghvi 等人，Current Opinion in Drug Discovery(2004)Vol.7N0.8 综述了用于寡核苷酸纯化的方法。该文献公开了其它方法。已使用各种方法用于纯化DNA和RNA序列。W0-A-01/55160公开了通过与污染物形成亚胺键然后釆用色谱法或其它技术除去亚胺连接的杂质以纯化寡核苷酸。“Size Fractionation of DNA Fragments Rangingfrom20to30000Base Pairs by Liquid/Liquid chromatography”，Muller 等人，Eur.J.BiOChem(1982) 128-238公开了使用其上已沉积了 PEG/右旋糖酐相的微晶纤维素实体柱用于分离核苷酸序列。“Separation and identification of oligonucleotides byhydrophilic interaction chromatography，，，Easter 等人，The Analyst (2010)，135 (10)公开了使用改进的HPLC利用固体二氧化娃载体相分离寡核苷酸。“Fractionationof oligonucleotides of yeast soluble ribonucleic acids by countercurrentdistribution”，Doctor 等人，Biochemistry (1965) 4 (I) 49-54 公开了使用包装干DEAE-纤维素的干实体柱。“Oligonucleotide composition of a yeast lysine transferribonucleic acid”，Madison 等人，Biochemistry，1974，13 (3)公开了使用固相色谱法用于分离核苷酸序列。维基百科在以下网址公开了使用亲水作用色谱，使用固体二氧化硅基质用于分离生物分子:http://en.wikipedia.0rg/wiki/Hydrophi lie—interaction—chromatography。 液-液色谱法是已知的分离方法。液-液色谱法使用双相性液体系统，该系统包含维持在伸长柱中的固定液相(类似于常规色谱中配置在管柱中的固相)，以及使之与固定相接触流经该柱的流动液相。在此流动中，物质将以类似于常规固相色谱的方式在流动相和固定相之间分配。在液-液色谱技术中流动相将物质洗脱分离为类似于常规液-固相色谱的不同级分。在液-液色谱中该方法通常无载体操作，即无需固体载体基质承载该液相，其依靠旋转柱内的离心力在该过程中维持它们的彼此接触关系。“CountercurrentChromatography-The Support-Free Liquid Stationary Phase，，，Billardello，B.，Berthod, As Comprehensive Analytical Chemistry38, Berthod, A.，编辑；Elsevier Science B.V.!Amsterdam(2002)pp177-200 提供了有用的液-液色谱法的一般说明。已知各种液-液色谱技术。一种技术是液-液逆流色谱法(在此称作“CCC”)。在CCC仪器中通常恒定内径的圆形例如螺旋形或螺旋管状柱两个都围着其圆形中心和从其中心移位的旋转轴旋转，即所谓的行星自传。此组合运动在柱中产生了振荡离心力场，导致沿着柱的混合和反混合区域。典型的CCC仪器公开在W0-A-03/086639 (布鲁奈尔大学)中。另一已知的技术是离心分配色谱法(在此称作“CPC”)。US-A-6，537，452和W0-A-2010/059715提出了使用CPC用于分离生物分子的可能性。“High PerformanceCentrifugal Partition Chromatography，，2005 (在线:http://web.archive, org/web/20050208201013/http://eversek0.c0.jp/p02.html)和“Applications ofLiquid-Liquid Chromatography Instrumentation for Laboratory Preparative&ProcessChemistry”,Brown 等人，Chromatography Today (Nov-Dec2009) 16-19 是关于 CPC 的一般性文章。“Anion-Exchange Displacement Centrifugal Partition Chromatography，，，Maciuk等人，Anal.Chem.(2004) 76，6179-6186公开了置换色谱法，其中羟基肉桂酸异构体分离通过在固定相中提供交换剂(或保留剂)物质以可去除地保留羟基肉桂酸在固定相上，然后使用置换剂物质将其从固定相置换。多种CPC仪器类型是市场上可购的，例如来自Kromaton (Rousselet RobatelGroup的一部分)。典型 地，CPC仪器包含含有许多(有时多至1000)个小腔的柱，该小腔有时称作“分配单元(partition cell) ”,其以一种或多种循环圆周排列以围着旋转轴旋转，这些分配单元通过流动通道相互连接以使液体可经过它们顺序流动。在一种已知排列中多个分配单元围着一圆盘蚀刻或加工，例如自金属例如不锈钢制备，以及多个圆盘沿着它们的中心旋转轴堆放以形成可围绕其旋转轴旋转的旋转体。具有相对少堆放圆盘以及相对更大体积分配单元的一些CPC仪器形式有时称作离心分配提取器(“CPE”)装置。典型的CPC 仪器例如公开在 US-A-6, 537，452 (Kromaton) ,W0-A-2004/079363 (Partus)中以及其它科学或商业文献中。在CPC方法中液相被引入一本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于从目标寡核苷酸和一种或多种杂质的混合物中分离目标寡核苷酸的方法，所述方法包括：提供包含第一液体流动相和液体固定相的双相性流动相‑固定相液‑液色谱系统，所述液体固定相含有可去除地结合目标寡核苷酸的至少一种交换剂物质；使所述第一液体流动相在液‑液色谱仪柱中相对于并与所述液体固定相接触的流动中携带所述目标寡核苷酸以使所述目标寡核苷酸在所述液体固定相中结合所述交换剂物质；然后通过可将所述目标寡核苷酸从所述液体固定相置换入第二流动相的置换剂物质将所述目标寡核苷酸从所述液体固定相置换入第二液体流动相，所述第二液体流动相相对于并与所述固定相接触流经所述柱。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.09.02 GB 1115218.81.用于从目标寡核苷酸和一种或多种杂质的混合物中分离目标寡核苷酸的方法，所述方法包括: 提供包含第一液体流动相和液体固定相的双相性流动相-固定相液-液色谱系统，所述液体固定相含有可去除地结合目标寡核苷酸的至少一种交换剂物质； 使所述第一液体流动相在液-液色谱仪柱中相对于并与所述液体固定相接触的流动中携带所述目标寡核苷酸以使所述目标寡核苷酸在所述液体固定相中结合所述交换剂物质； 然后通过可将所述目标寡核苷酸从所述液体固定相置换入第二流动相的置换剂物质将所述目标寡核苷酸从所述液体固定相置换入第二液体流动相，所述第二液体流动相相对于并与所述固定相接触流经所述柱。2.根据权利要求1的方法，包括以下步骤: (1)提供在溶液中含有所述目标寡核苷酸和一种或多种杂质的第一液相，以及含有可去除地结合所述目标寡核苷酸的交换剂物质的第二液相，当彼此接触时所述第一液相和第二液相形成两个不同的相； (2)将所述第二液相作为其中的固定液相引入离心分配色谱仪中； (3)将在溶液中含有所 述目标寡核苷酸和一种或多种杂质的第一液相作为第一流动相引入所述离心分配色谱仪中，并使该第一液相流经所述离心分配色谱仪以与所述第二液体固定相接触，使所述目标寡核苷酸在所述第二液体固定相中可去除地结合所述交换剂物质； (4)将当与所述第二液相接触时形成不同相并在溶液中含有可将所述目标寡核苷酸从所述第二液相置换的至少一种置换剂物质的第三液相作为第二流动相引入所述离心分配色谱仪中，并使该第二流动相流经所述离心分配色谱仪以与所述第二液相接触，使所述目标寡核苷酸从所述固定相中置换并进入所述第二流动相中的溶液中； (5)从所述第二流动相中分离所述置换的目标寡核苷酸。3.根据权利要求1或2的方法，其中所述目标寡核苷酸包含10-30个碱基。4.根据权利要求3的方法，其中所述目标寡核苷酸是具有序列5’ -UCAAGGAAGAUGGCAUUUCA-3’ 的 20 个碱基寡核苷酸。5.根据权利要求1至4任一项的方法,其中所述目标寡核苷酸与也为寡核苷酸的一种或多种杂质分离。6.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述固定相包含基本上不与水混溶的一种或多种有机液体以及与水混溶的一种或多种有机液体的混合物。7.根据权利要求6的方法，其中所述第一和第二流动相包含与水混溶的一种或多种有机液体以及水的混合物。8.根据权利要求6或7的方法，其中所述固定相和流动相包含含有Cu链烷酸CV6烷基酯、C1^8链烷醇和水的液体系统的各自两个平衡相。9.根据权利要求8的方法，其中所述CV6链烷酸Cm烷基酯是乙酸乙酯且所述CV8链烷醇是1-丁醇。10.根据权利要求6或7的方法，其中所述固定相和流动相包含含有CV8链烷醇和水的液体系统的各自两个平衡相。11.根据权利要求10的方法，其中所述Ci_8链烷醇...

【专利技术属性】
技术研发人员：N多伊利特，K弗里拜恩，H古兹利克，J休伯特，JH雷诺尔特，C西基特，
申请(专利权)人：葛兰素集团有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB