本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体涉及酒醅中梭菌、乳酸菌和芽孢杆菌的定量分析方法。本发明专利技术要解决的技术问题是为分析酒醅中梭菌、乳酸菌、芽孢杆菌提供一种新选择。本发明专利技术的技术方案是窖泥中梭菌、乳酸菌和芽孢杆菌的定量分析方法，包括如下步骤：a、标准曲线的制备；b、提取基因组DNA；c、扩增；d、定量分析。本发明专利技术方法可用于分析窖泥中的梭菌、乳酸菌和芽孢杆菌的变化趋势。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，具体涉及。
技术介绍
我国白酒的生产历史悠久，但众多白酒生产厂家的发酵过程都以传统的经验为主，工艺可控性较差，并且产品品质存在批次差异，尤其是风味差异较大。这主要是由于酿造过程中微生物复杂多样，对白酒发酵过程中的微生物作用机制不清楚。中国白酒的酿造工艺是多菌种混合发酵工艺，通过多种微生物的代谢作用产生不同风味的白酒。白酒的生产中有三个主要的发酵阶段:主发酵期、生酸期以及产香味期。在主发酵期，淀粉质原料如糯米、高粱等经过微生物的一系列代谢作用，最终生成酒精的阶段；在生酸期，窖内的酒醅经过复杂的生物化学等变化，产生大量的有机酸，其中细菌代谢活动酸类物质生成的主要途径；产香味期，在该阶段发酵前期产生的乙醇和酸类物质，经微生物产生的酶的催化作用形成大量酯类物质和其他的香味物质。因此，发酵过程酒醅微生物群落结构和数量是影响白酒风味物质形成的重要因素。研究者采用传统培养、现代分子生物学技术等方法，对酒醅中微生物群落结构进行分析和研究，发现乳酸菌、梭菌、芽孢杆菌是酒醅微生物菌群中的主要功能菌，但这3类微生物在发酵过程中的动态变化情况不清楚，因此阐明发酵过程中乳酸菌、梭菌、芽孢杆菌生物量的动态变化，对阐明白酒动态发酵过程以及白酒风味物质的形成都具有重要的意义。通过传统培养与现代分子生物学技术，对酒醅中微生物群落结构进行分析和研究，了解了酒醅中主要微生物群落结构的组成，但是，酒醅主要的微生物定量检测缺乏一种合理、快捷的方法，传统对酒醅中微生物定量检测的方法，仍然采用选择培养基的筛选和纯培养分离计数的方法，但是，该方法受到外界环境因素，菌种特性等影响，检测结果缺乏稳定性和可靠性，且耗时费力。荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术不仅实现了 DNA模板的定量，而且具有特异性强、灵敏度高、高通量、反应全封闭、定量准确、速度快及自动化程度高等特点，已成为在分子生物学及微生物领域中重要的定量方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种分子生物技术用于定量检测酒醅发酵过程中乳酸菌、梭菌、芽孢杆菌生物量的动态变化，以指导实践。本专利技术的技术方案是，包括如下步骤:a、标准曲线的制备:设计针对梭菌、乳酸菌和芽孢杆菌的标准细菌的特异性引物，然后进行荧光定量PCR，根据拷贝数与CT值构建的标准曲线；b、提取基因组DNA:利用洗脱、酶消化结合的方法提取提取酒醅微生物群落的宏基因组；C、扩增:采用梭菌、乳酸菌和芽孢杆菌的特异性引物，对酒醅微生物宏基因组中梭菌、乳酸菌和芽孢杆菌的特异性片段进行扩增；d、定量分析:通过标准曲线和待测样品的CT值对窖泥微生物群落中梭菌、乳酸菌和芽孢杆菌进行定量分析。具体的，步骤a和c中扩增乳酸菌的特异性引物如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所/Jn ο具体的，步骤a和c中扩增梭菌的特异性引物如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。具体的，步骤a和c中扩增芽孢杆菌的特异性引物如SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示。 乳酸菌特异性引物序列(5' — 3'):Lacto-F:AGAACACCAGTGGCGAAGG (SEQ ID N0.1)；Lacto-R:CAGGCGGAGTGCTTAATGC (SEQ ID N0.2)。梭菌特异性引物序列(5' — 3'):Clost-F:AAAGGRAGATTAATACCGCATAA (SEQ ID N0.3)；Clost-R:TTCTTCCTAATCTCTACGCA (SEQ ID N0.4)。芽孢杆菌特异性引物序列(5' — 3'):Bacil-F:ATGGCTGTCGTCAGCT (SEQ ID N0.5)；Bacil-R:ACGGGCGGTGTGTAC (SEQ ID N0.6)。上述引物中的R为A或G。具体的，步骤a中的操作如下:从酒醅微生物群落中提取分离纯化得到的I株梭菌(Clostridium butyricum)、I 株乳酸菌(Lactobacillus crustorum)、I 株芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的基因组,然后分别利用特异性引物进行PCR得到特异性目的片段，再将目的片段与TA克隆载体连接，获得重组质粒，再将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆转化子，提取得到高浓度质粒，然将此高浓度质粒做10倍比稀释，作为荧光定量PCR的标准样品，从而进行荧光定量PCR获得标准曲线。具体的，步骤a和c中扩增梭菌特异性片段的PCR反应程序为:95°C预变性4min后，进入30个循环，95°C lmin ；57°C lmin ;72。。lmin，最后72°C延伸IOmin ;扩增乳酸菌、芽孢杆菌特异性片段的PCR反应程序为:95°C预变性4min后，进入30个循环，95°C lmin ；55°C lmin ；72°C lmin，最后 72°C延伸 IOmin0具体的，步骤b中利用洗脱、酶消化结合的方法提取酒醅微生物群落的总DNA的具体步骤如下:称取Ig酒醅样品于50mL离心管，向离心管加入5mL PBS缓冲液pH7.64和8~9颗灭菌玻璃珠，漩涡震荡5min，200 X g离心5min，在冰上吸取上清液；在沉淀中加入5mLPBS缓冲液重复洗涤两次，合并三次上清液，12000rpm离心5min，取沉淀；加入ImL CTAB抽提液(2%CTAB、5mol/L NaCl、lmol/L ρΗ8.0 的 Tris_HCl、0.5mol/L EDTA)和 20 μ L 巯基乙醇至离心管中，65°C恒温混匀仪振荡30min，加入5 μ L20mg/mL蛋白酶k，37°C 220r/min30min,室温6000 Xg离心10min，收集ImL上清；加入等体积Tris-饱和酚-氯仿-异戊醇，抽提一次，12000rpm离心10min,取上清加入等体积氯仿-异戍醇12000rpm离心10min,取上清,重复两次；上清液加入0.6倍体积预冷的异丙醇,_20°C沉淀lh, 12000rpm离心10min,倒掉液体；沉淀用70%乙醇洗涤，12000r/min离心10min ;洗涤后的DNA吹干后TE溶解，_20°C冰箱保存备用；其中所述的0^8抽提液配方为2%0^8、5!1101/1恥(:1、111101/1?!18.0的1^8-!1(:1、0.5mol/L EDTA ；Tris-饱和酹-氯仿-异戍醇的体积比25: 24:1 ;氯仿-异戍醇的体积比 24: I。【附图说明】图1酒醅样品中乳酸菌的拷贝数在白酒发酵过程中的动态变化曲线图2酒醅样品中梭菌的拷贝数在白酒发酵过程中的动态变化曲线图3酒醅样品中芽孢杆菌的拷贝数在白酒发酵过程中的动态变化曲线图1~3中横轴天数表示酒醅发酵天数【具体实施方式】在本专利技术中，荧光定量PCR采用Bio-Rad专用定量PCR试剂SsoFast EvaGreen预混液，该预混液使用专利的Sso7d融合蛋白技术，在广泛的定量PCR应用中有卓越的表现。通过新型的热启动工程融合聚合酶结合优化的缓冲液和ROX惰性参照染料，在短时间内可以获得重复性更本文档来自技高网...
【技术保护点】
酒醅微生物群落中乳酸菌、梭菌、芽孢杆菌的定量分析方法，其特征在于：包括如下步骤：a、标准曲线的制备：设计针对梭菌、乳酸菌和芽孢杆菌的标准细菌的特异性引物，然后进行荧光定量PCR，根据拷贝数与CT值构建的标准曲线；b、提取基因组DNA：利用洗脱、酶消化结合的方法提取提取酒醅微生物群落的宏基因组；c、扩增：采用梭菌、乳酸菌和芽孢杆菌的特异性引物，对酒醅微生物宏基因组中梭菌、乳酸菌和芽孢杆菌的特异性片段进行扩增；d、定量分析：通过标准曲线和待测样品的CT值对窖泥微生物群落中梭菌、乳酸菌和芽孢杆菌进行定量分析。
【技术特征摘要】
1.酒醅微生物群落中乳酸菌、梭菌、芽孢杆菌的定量分析方法，其特征在于:包括如下步骤: a、标准曲线的制备:设计针对梭菌、乳酸菌和芽孢杆菌的标准细菌的特异性引物，然后进行荧光定量PCR，根据拷贝数与CT值构建的标准曲线； b、提取基因组DNA:利用洗脱、酶消化结合的方法提取提取酒醅微生物群落的宏基因组； C、扩增:采用梭菌、乳酸菌和芽孢杆菌的特异性引物，对酒醅微生物宏基因组中梭菌、乳酸菌和芽孢杆菌的特异性片段进行扩增； d、定量分析:通过标准曲线和待测样品的CT值对窖泥微生物群落中梭菌、乳酸菌和芽孢杆菌进行定量分析。2.如权利要求1所述的酒醅微生物群落中乳酸菌、梭菌、芽孢杆菌的定量分析方法，其特征在于:步骤a和c中扩增乳酸菌的特异性引物如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。3.如权利要求1或2所述的酒醅微生物群落中乳酸菌、梭菌、芽孢杆菌的定量分析方法，其特征在于:步骤a和c中扩增梭菌的特异性引物如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。4.如权利要求1~ 3任一项所述的酒醅微生物群落中乳酸菌、梭菌、芽孢杆菌的定量分析方法，其特征在于:步骤a和c中扩增芽孢杆菌的特异性引物如SEQ ID N0.5和SEQ IDN0.6所示。5.如权利要求1~4...
【专利技术属性】
技术研发人员：许正宏，史劲松，陆震鸣，肖辰，黄志勇，王松涛，邓波，代宇，曾娜，刘世龙，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，江南大学，泸州品创科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12
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