一种提高基因连接测序准确性的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高基因连接测序准确度的方法，其中测序所使用的测序引物（3）或连接臂序列（4）是含有硫代修饰的核苷酸序列；使用T7核酸外切酶将未参与连接反应的测序引物(3)全部或者部分降解；另外当连接臂序列（4）与测序引物（3）发生连接反应后，如果延长引物（5）的5’末端碱基未能有效与未知序列DNA模板(1)配对，可通过T7核酸外切酶降解至硫代修饰的核苷酸片段，从而将未配对的碱基有效清除。本发明专利技术的方法缩短了测序的时间，提高了连接测序的准确性，使其在使用价格便宜的寡核苷酸探针试剂后，仍然维持连接测序的高准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种提高基因连接测序准确性的方法
本专利技术是一种实现了提高DNA序列分析准确性的方法，具体涉及一种提高高通量基因连接测序准确性的方法，属于生物
技术背景全基因组DNA测序技术对从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用提供了技术平台，已经成为国际上一个竞争十分激烈的研究领域。全基因组DNA测序技术大体上可以分成三大类：第一类是合成测序，在碱基加入到正在延伸的DNA链的过程当中进行检测；第二类技术则是杂交测序法，通过制备一组高密度寡核苷酸微阵列芯片的杂交信号，进行目标基因的序列鉴定。第三类为在单分子的水平上进行测序的技术。实际上，目前只有合成测序方法在商业化水平上实现了全基因组测序，即所谓第二代高通量测序技术，主要包括合成测序和连接测序两大类。1）合成测序技术其测序化学的一个共同的策略是通过聚合酶反应，即DNA复制过程来实现的。其商业化仪器包括Roch（454LifeSciences）公司采用焦磷酸测序化学技术的GenomeSequencerTM系统；LifeTechnologies公司利用检测H+浓度的离子半导体（IonTorrent）测序平台；Illumina（Solexa）公司GenomeAnalyzer测序平台。2）连接测序技术其测序方法是以四色荧光标记寡核苷酸探针的连接合成为基础，取代了传统的聚合酶连接反应，使用了DNA连接酶进行测序。其商业化技术包括AppliedBiosystems公司的SOLiDSystem双碱基编码寡核苷酸探针连接测序技术，CompleteGenomics连接测序等。连接测序是第二代高通量测序方法之一，它的最大特点是测序的高准确性（尤其在双编码探针测序中，该方法可以区分测序错误与单碱基多态性（SNP），当然它的最大不足使测序长度相对于延伸合成测序方要短很多。然而，即使有阅读片段短的不足，但在使用价格便宜的寡核苷酸探针试剂后，该测序技术仍然在RNA、基因组重测序等应用方面方面获得了广泛的应用，并最有可能推向临床应用。价格便宜的组合寡核苷酸探针连接测序方法中每个测序引物测定10个碱基序列：首先利用分别在第1、2、3、4、5位置标识碱基的探针与第一个测序引物进行连接反应，测定DNA模板对应的第1、2、3、4、5位置碱基信息；而当需要测定DNA模板6～10位置碱基信息时，先在第一个测序引物上连接一个非标记的连接臂序列，向外延伸了5个碱基，然后再采用测定第1、2、3、4、5位置碱基的方法将6、7、8、9、10位置的碱基信息确定。很明显在进行第6、7、8、9、10位置的碱基序列测定时，由于未能对连接失败的延长引物进行有效处理，会出现不同步引物，以及末端发生错配的碱基序列，从而影响连接测序的准确性。为了降低错误信号，目前采用的方法是将测序引物与连接臂序列进行多次连接反应，尽可能使测序引物与连接臂完全发生反应。然而，这样处理一方面大大增加了测序的操作时间，另一方面，有限次的连接反应也不能完全消除测序错误。T7核酸外切酶作用于双链DNA，沿5´→3´方向催化去除5´单核苷酸，它既能从5´末端起始消化，也能从双链DNA的切刻或缺口处起始消化。它既能降解5´端磷酸化DNA,也能降解5´端去磷酸化DNA。该酶的另一个特点是降解受阻于连续4个或者四个以上硫代修饰的核苷酸序列（参见：NikiforovTT，etal.硫代磷酸引物的使用和外切核酸酶水解制备单链PCR产物用于固相杂交检测.基因组研究.19943:285-291;HsuHL,etal.用于强化多个病原体定量检测和鉴定的单链多重聚合酶链反应扩增产物悬浮微珠阵列.分析化学.2013,85,5562−5568）,文献中利用该酶的这一特点，将PCR中的其中一条引物的5’端进行硫代修饰，得到的PCR产物通过T7核酸外切酶切割另一条未进行硫代修饰的单链，最后得到硫代修饰的单链DNA用于核酸序列的杂交分析。即目前T7核酸外切酶与硫代修饰DNA链的配合运用的目的是用于制备单链DNA，并未用于测序，因此与本专利技术的目的存在较大差异。
技术实现思路
本专利技术的目的是有选择性地对未参与连接反应的测序引物进行降解，或者降解延长引物5’末端错配碱基，从而清除不同步测序引物，修正未完全杂交的测序引物，提高连接测序的准确性，使其在使用价格便宜的寡核苷酸探针试剂后，仍然维持连接测序的高准确性。本专利技术中的提高基因连接测序准确性的方法，方法为：测序引物与固定在固相载体上的未知序列DNA模板杂交后，再与连接臂序列进行连接反应，由测序引物与连接臂序列共同组成的延长引物与连有荧光标记的探针连接，然后进行测序，所述的测序引物或者连接臂序列是含有硫代修饰的核苷酸序列；使用T7核酸外切酶将未参与连接反应的测序引物全部或者部分降解，其中全部降解的测序引物被清除，而部分降解的测序引物通过提高温度被变性清除；另外当连接臂序列与测序引物发生连接反应后，如果延长引物的5’末端碱基未能有效与未知序列DNA模板配对，可通过T7核酸外切酶降解至硫代修饰的核苷酸片段，从而将未配对的碱基有效清除。所述的测序引物或者连接臂序列中硫代修饰核苷的个数为连续4个或者4个以上。所述的探针为单碱基标记序列和双碱基编码标记序列。与现有技术相比，本专利技术的最大优点是使用硫代修饰的测序引物或连接臂序列与T7核酸外切酶相互配合进行连接测序，消除了连接测序反应中测序引物不同步，即测序反应中存在两种不同测序引物的问题，减少了基因连接测序的步骤，缩短了所需的时间，大大提高测序反应的准确性，解决了一直以来本领域的技术人员想解决但是未能解决的技术问题。并且在使用价格便宜的寡核苷酸探针试剂后，仍然维持连接测序的高准确性，降低了基因连接测序的成本。附图说明图中：DNA模板1，固相载体2，测序引物3，连接臂序列4，延长引物5，探针6，荧光标记7。以下将结合附图对本专利技术作进一步说明。图1是本专利技术一种提高基因连接测序准确性的方法（沿测序引物的3’-5’）示意图。图1中，未知序列的DNA模板1固定到固相载体2上，5’端磷酸化修饰的测序引物3（即为5’-PO43--CACCGACTGCCCATA，参见表1）与DNA模板1杂交反应后，与连接臂序列4（即为5’-NSNSNSNSNNN，参见表1）进行连接反应（a）；加入T7核酸外切酶进行酶切反应（b）降解未发生连接反应的测序引物3，经过T7核酸外切酶酶切后，便全部降解掉，而连接连接臂序列4后构成的延长引物5的5’端核苷由于被硫代修饰，所以碱基被保护，不能被T7核酸外切酶降解。如连接臂序列4为5’-NNNNSNSNSNSNN（参见表1），则由其组成的延长引物5经过T7核酸外切酶酶切后，便降解掉5’端的三个NNN碱基。最后加入T4激酶将延长引物5的5’端磷酸化（c），然后加入连有5’端荧光标记7的寡核苷酸探针6进行连接测序反应（d）。图2是本专利技术一种提高基因连接测序准确性的方法（沿测序引物的5’-3’）示意图。图2中，未知序列的DNA模板1固定到固相载体2上，硫代修饰的测序引物3（即为5’-CACCGACTGSCSCSCSATA，参见表1）与DNA模板1杂交反应后，与3’、5’均经磷酸化修饰的连接臂序列4（即为5’-PO43--NNNNNNN-PO43--，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高基因连接测序准确性的方法，方法为：测序引物(3)与固定在固相载体（2）上的未知序列DNA模板(1)杂交后，再与连接臂序列（4）进行连接反应，由测序引物(3)与连接臂序列(4)共同组成的延长引物（5）与连有荧光标记（7）的探针（6）连接，然后进行测序，其特征在于所述的测序引物(3)或者连接臂序列(4)是含有硫代修饰的核苷酸序列；使用T7核酸外切酶将未参与连接反应的测序引物(3)全部或者部分降解，其中全部降解的测序引物被清除，而部分降解的测序引物(3)通过提高温度被变性清除；另外当连接臂序列（4）与测序引物（3）发生连接反应后，如果延长引物（5）的5’末端碱基未能有效与未知序列DNA模板(1)配对，可通过T7核酸外切酶降解至硫代修饰的核苷酸片段，从而将未配对的碱基有效清除。

【技术特征摘要】
1.一种提高基因连接测序准确性的方法，方法为：测序引物(3)与固定在固相载体（2）上的未知序列DNA模板(1)杂交后，再与连接臂序列（4）进行连接反应，由测序引物(3)与连接臂序列(4)共同组成的延长引物（5）与连有荧光标记（7）的探针（6）连接，然后进行测序，其特征在于所述的测序引物(3)或者连接臂序列(4)是含有硫代修饰的核苷酸序列；使用T7核酸外切酶将未参与连接反应的测序引物(3)全部或者部分降解，其中全部降解的测序引物被清除，而部分降...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖鹏峰，何磊，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32