DNA甲基转移酶3α基因位点分型检测方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种DNA甲基转移酶3α基因位点分型检测方法和检测用试剂盒，该方法包括如下步骤：以基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到PCR的扩增产物；PCR的扩增产物进行LDR扩增，得到LDR的扩增产物；用测序仪的Genescan功能对LDR的扩增产物进行分析，判断各耐药位点的基因型，提供具体药物相关位点的信息。本发明专利技术的DNA甲基转移酶3α基因位点分型检测方法及检测试剂盒采用PCR关联LDR方法（聚合酶链式反应关联连接酶检测反应）进行检测，能够方便检出DNMT3α的各种基因分型，具有结果可靠稳定、操作简单、快速的特点，简化了传统的PCR测序检测方法中，产物纯化和沉淀等繁琐步骤，减少检测时间，有较大的临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种急性髓系白血病突变基因的检测方法，尤其涉及一种DNA甲基转移酶3α（DNMT3α）基因位点分型检测方法及检测试剂盒。
技术介绍
急性髓系白血病是目前危害青少年的最严重的疾病之一， DNMT3α突变为急性髓系白血病预后判断提供了新的分子生物学标记，尤其是R882位点是突变的热点。 连接酶检测反应（LDR，ligase detection reaction）是近年来发展的一种核酸检测技术，是在反应中仅加入一对探针，模板被线性扩增。主要应用于单核苷酸检测领域，如单核苷酸多态性检测（SNP）（Detection of HLA Polymorphisms by Ligase Detection Reaction and a Universal Array Format: A Pilot Study for Low Resolution Genotyping. Clarissa Consolandi, Elena Busti, Cinzia Pera, et al; Human Immunology 64, 168–178 (2003)）。近几年，又出现了将LDR技术和PCR（聚合酶链式反应）技术关联使用（Norman P. Gerry1 et al., J. Mol. Biol. (1999) 292, 251-262, U.S. Pat. Pub. No. 2003/0032016A1）。同时，随着LDR技术的逐步成熟，相关LDR检测产品也在不断问世，如肿瘤化疗疗效及毒副作用检测的LDR方案，心脑血管疾病易感基因LDR检测等产品。目前，已经有人成功报道了将乙型肝炎病毒中的YMDD和YIDD用LDR技术在测序平台上进行了成功检测（A novel method based on ligase detection reaction for low abundant YIDD mutants detection in hepatitis B virus. Zhenxian X. and, Junxua X,et al Hepatology Research 34 (2006) 150–155）。的那是针对目前的检测，所有的相关的位点都是单碱基突变。还没有开发出针对多基因位点的检测技术与方法。     有鉴于上述现有的多基因位点的检测技术存在的缺陷，本专利技术人基于从事此类产品设计制造多年丰富的实务经验及专业知识，并配合学理的运用，积极加以研究创新，以期创设一种新型DNA甲基转移酶3α基因位点分型检测方法及检测试剂盒，使其更具有实用性。经过不断的研究、设计，并经反复试作样品及改进后，终于创设出确具实用价值的本专利技术。
技术实现思路
    本专利技术的主要目的在于，克服现有的基因位点检测存在的缺陷，而提供一种新型DNA甲基转移酶3α基因位点分型检测方法及检测试剂盒从而更加适于实用，且具有产业上的利用价值。 本专利技术的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本专利技术提出的一种DNA甲基转移酶3α基因位点分型检测方法，该方法包括如下步骤： 以基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到PCR的扩增产物； PCR的扩增产物进行LDR扩增，得到LDR的扩增产物； 用测序仪的Genescan功能对LDR的扩增产物进行分析，判断各耐药位点的基因型，提供具体药物相关位点的信息。 本专利技术检测DNMT3α基因位点的原理： 1、PCR技术的基本原理： 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。 2、LDR技术原理： LDR是利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别。高温连接酶一旦检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配，则连接反应就不能进行。并通过温控循环该特异性连接反应可反复进行，达到线性扩增的效果。 3、DNMT3α检测序列 GGATTGTTCAAAATTACTCTTATTTCTGCTGGGTTGTGAAACTCTAGGCAGTGATGACCTTACTACCTTTAAGGTCACAGAAACCAGCACAGTGCCTGGCACATGGTTGGTGATCTGAGTGCCGGGTTGTTTATAAAGGACAGAAGATTCGGCAGAACTAAGCAGGCGTCAGAGGAGTTGGTGGGTGTGAGTGCCCCTGTCCCTGCACTTCGGGTGGCTGCTGGTCCTCCGGGTCCTGCTGTGTGGTTAGACGGCTTCCGGGCAGCCTGGTCTGGCCAGCACTCACCCTGCCCTCTCTGCCTTTTCTCCCCCAGGGTATTTGGTTTCCCAGTCCACTATACTGACGTCTCCAACATGAGCCG/ACTTGGCGAGGCAGAGACTGCTGGGCCGGTCATGGAGCGTGCCAGTCATCCGCCACCTCTTCGCTCCGCTGAAGGAGTATTTTGCGTGTGTGTAAGGGACATGGGGGCAAACTGAGGTAGCGACACAAAGTTAAACAAACAAACAAAAAACACAAAACATAATAAAACACCAAGAACATGAGGATGGAGAGAAGTATCAGCACCCAGAAGAGAAAAAGGAATTTAAAACAAAAACCACAGAGGCGGAAATACCGGAGGGCTTTGCCTTGCGAAAAGGGTTGGACATCATCTCCTGATTTTTCAATGTTATTCTTCAGTCCTATTTAAAAACAAAACCAAGCTCCCTTCCCTTCCTCCCC 更进一步的的，前述的DNA甲基转移酶3α基因位点分型检测方法，所述PCR扩增时的引物为一对正向引物和反向引物。 更进一步的，前述的DNA甲基转移酶3α基因位点分型检测方法，所述正向引物序列为：5’-TCCTGCTGTGTGGTTAGACG-3’；所述反向引物序列为：5’-CCATGTCCCTTACACACACG-3’。 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA甲基转移酶3α基因位点分型检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：以基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到PCR的扩增产物；对PCR的扩增产物进行LDR扩增，得到LDR的扩增产物；对LDR的扩增产物进行分析，判断各耐药位点的基因型。

【技术特征摘要】
1.一种DNA甲基转移酶3α基因位点分型检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
以基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到PCR的扩增产物；
对PCR的扩增产物进行LDR扩增，得到LDR的扩增产物；
对LDR的扩增产物进行分析，判断各耐药位点的基因型。
2.根据权利要求1所述的DNA甲基转移酶3α基因位点分型检测方法，其特征在于，所述PCR扩增时的引物为一对正向引物和反向引物。
3.根据权利要求2所述的DNA甲基转移酶3α基因位点分型检测方法，其特征在于，所述正向引物序列为：5’-TCCTGCTGTGTGGTTAGACG-3’；
所述反向引物序列为：5’-CCATGTCCCTTACACACACG-3’。
4.根据权利要求1所述的DNA甲基转移酶3α基因位点分型检测方法，其特征在于，所述LDR扩增时采用的探针为荧光标记探针和检测探针。
5.根据权利要求4所述的DNA甲基转移酶3α基因位点分型检测方法，其特征在于，所述荧光标记探针的荧光基团为5-FAM、6-FAM、TAMRA、HEX、TET、JOE、...

【专利技术属性】
技术研发人员：祁小飞，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32