本发明专利技术公开了一种快速鉴定致病性香鱼假单胞菌的多重PCR检测试剂盒及其方法，所述试剂盒包括TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸混合物、重蒸水以及假单胞菌、香鱼假单胞菌、致病性香鱼假单胞菌的引物对，而应用该试剂盒快速鉴定致病性香鱼假单胞菌的多重PCR检测方法包括假单胞菌的初步分离及多重PCR扩增，与现有技术相比，本发明专利技术的优点在于：使用本发明专利技术的试剂盒进行检测就能快速地检测出与上述三种假单胞菌的DNA引物相对应的假单胞菌、香鱼假单胞菌、致病性香鱼假单胞菌，另外本发明专利技术的检测方法利用上述的试剂盒能快速、灵敏、特异地测定假单胞菌的存在，同时还能区分致病株与无毒力的环境分离株。
【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴定致病性香鱼假单胞菌的多重PCR检测试剂盒及其方法
本专利技术涉及香鱼假单胞菌的检测技术，尤其一种涉及快速鉴定致病性香鱼假单胞菌的多重PCR检测试剂盒及其方法。
技术介绍
已经报道对鱼类有致病性的假单胞菌种类有杀鳗假单胞菌(Pseudomonasanguillacida)、突光假单胞菌(P.fIuorescens)、恶臭假单胞菌(P.putida)和香鱼假单胞菌(P.plecoglossicida)等,其中后3种同属于突光型假单胞菌DNA I型,在形态和部分理化特性上相似，尤其是恶臭假单胞菌与香鱼假单胞菌，此两种菌在分类上同属于恶臭假单胞菌组，在理化特性上非常接近，16S rRNA基因序列同源性达99%以上，常规的理化特性鉴定和16S rRNA基因测序比对均不能有效区分这两种菌。香鱼假单胞菌NB2011是对大黄鱼致病的强毒株，引起大黄鱼内脏白点病；对NB2011株基因组的解悉结果表明，该菌株存在III型分泌系统(Type III secretion system, TTSS),其基因排列与人类病原菌铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)存在的TTSS相似，但部分结构和功能基因序列上存在较高的特异性，如exoU可能是NB2011TTSS向宿主细胞分泌的最重要的细胞毒素，其氨基酸序列与铜绿假单胞菌相应蛋白(WP_023097922)的同源性最高，也仅为45%，核苷酸序列上则没有明显相似性；exoU的分泌则受到调节蛋白exsA的严格调控，NB2011exsA与铜绿假单胞菌相应蛋白(NP_250404)的同源性为65%，核苷酸序列相似性低于70%，这种特异性为鉴别致病菌株提供了良好的基础。香鱼假单胞菌同时是自然环境如水体中微生物种群的正常成员，环境分离株一般对鱼类没有毒 力；先期的预备试验结果表明，环境分离的香鱼假单胞菌株中不存在TTSS和相应的毒力因子及调控蛋白。因此预先分析、检测确定感染菌的种类和致病性就显得尤为重要。目前检测香鱼假单胞菌感染的方法主要包括:生理生化检测、组织病理学观察、显微镜检以及PCR等生物技术诊断方法。对鱼类致病菌香鱼假单胞菌的检测如一申请号201210466878.5 (公布号为CN102952884A)的中国专利技术专利申请《一种鱼类致病菌香鱼假单胞菌的LAMP检测试剂盒及检测方法》公开了如下的试剂盒:包括反应缓冲液、MgS04溶液、dNTP液、Bst DNA聚合酶液、甜菜碱溶液、FIP/BIP引物溶液、F3/B3引物溶液和双蒸水，该LAMP检测试剂盒对香鱼假单胞菌具有高灵敏度、高特异性，但是此方法采用菌株中普遍存在的看家基因rpoD为靶基因序列，不能同时区分有毒力的病原株和无毒力的环境分离株，缺乏足够的特异性。因此，本研究开发了一种多重PCR法，可以快速鉴别常规假单胞菌和香鱼假单胞菌，同时检测出其中的致病性菌株，区分无毒力的环境分离株。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题是提供一种快速鉴定致病性香鱼假单胞菌的多重PCR检测试剂盒，该检测试剂盒可以快速、灵敏、特异地测定香鱼假单胞菌的存在，同时区分致病株与无毒力的环境分离株。本专利技术所要解决的另一个技术问题是提供一种应用试剂盒快速鉴定致病性香鱼假单胞菌的多重PCR检测方法，用该检测试剂盒检测致病性香鱼假单胞菌的方法，可以为水产养殖中相关细菌检测及环境细菌监测提供技术手段。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为:该快速鉴定致病性香鱼假单胞菌的多重PCR检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸混合物、重蒸水以及假单胞菌、香鱼假单胞菌、致病性香鱼假单胞菌的引物对；其中，假单胞菌RNA聚合酶亚单位gyrB的上下游引物为:P1:5，CAACTCSGGCGTTGGCATYCTGCT3，；P2:5，CARG ATCGCCTGGGTRCGACGGTT3，；香鱼假单胞菌gyrB的上下游引物为:P3:5， CTGCTGAAGGACGAGCGTTC3，；P4:5 ’ GGTCATCTCACGAGCTTTCG3，； 致病性香鱼假单胞菌III型分泌系统调节因子exsA的上下游引物为:P5:5， TTGCTCAGCGAGATCAAAC3，；P6:5 ’ GCTCATCTATCCAAACCCTC3，。进一步地，所述试剂盒具体由下列试剂组成=TaqDNA聚合酶0.05mL、10 XPCR缓冲液0.5mL、脱氧核糖核苷三磷酸混合物0.25mL、重蒸水5mL以及浓度分别为10 μ M的假单胞菌、香鱼假单胞菌、致病性香鱼假单胞菌的引物对200 μ L0本专利技术还提供了应用上述试剂盒快速鉴定致病性香鱼假单胞菌的多重PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤:I)假单胞菌的初步分离:从假单胞菌的培养基中提取基因组DNA，备作PCR模板；其中，假单胞菌CFC选择性培养基自病鱼内脏和养殖水样中无菌分离可疑菌落，以LB培养基培养至对数生长期，经十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB法)提取基因组DNA，备作PCR模板。2)多重PCR扩增包括:a、多重PCR扩增反应体系:反应体系为20-30.0 μ L，各反应产物分别为TaqDNA聚合酶0.02U/ μ L，PCR缓冲液2.5 μ L，脱氧核糖核苷三磷酸混合物 1.0mmoI/L,引物 Ρ1、Ρ2 各 0.2-0.24ymol/L, P3、P4 各 0.4-0.6ymol/L, P5、P6 各0.32-0.48 μ mol/L，余量用重蒸水补足；b、扩增反应条件:94°C预变性4min，94°C变性30s，60.4°C退火45s，72°C延伸40s，循环30次，72°C终末延伸IOmin ;c、将步骤b的扩增产物进行电泳检测及结果分析。进一步地，所述步骤a的多重PCR扩增的反应体系具体为25.0 μ L，各反应产物分别为TaqDNA聚合酶0.25 μ L，10 X PCR缓冲液2.5 μ L，脱氧核糖核苷三磷酸混合物1.0 μ L，引物Ρ1、Ρ2各0.5 μ L，Ρ3、Ρ4各L O μ L，Ρ5、Ρ6各L O μ L，重蒸水补足至总体积25.0 μ L。通过电泳检测及结果分析，(I)若发现PCR产物只有745bp的一条带，指示了检测菌株为假单胞菌属恶臭假单胞菌相近种类；(2)若发现PCR产物出现745bp和570bp的两条带，指示了检测菌株为香鱼假单胞菌环境分离株；(3)若发现PCR产物有745bp、570bp和446bp的三条带，指示检测菌株为致病性香鱼假单胞菌；(4 )若发现无PCR产物，或无上述特征性条带，指示非假单胞菌属其他细菌。与现有技术相比，本专利技术的优点在于:使用本专利技术的试剂盒进行检测就能快速地检测出与上述三种假单胞菌的DNA引物相对应的假单胞菌、香鱼假单胞菌、致病性香鱼假单胞菌，另外本专利技术的检测方法利用上述的试剂盒能快速、灵敏、特异地测定假单胞菌的存在，同时还能区分致病株与无毒力的环境分离株，检测耗时短，操作简捷，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求，并对仪器要求简单，为香鱼假单胞菌病的早期防治提供技术支持。保藏说明1、大黄鱼致病株NB2011,即香鱼假单胞菌Pseudomonas plecoglossicida,于 2014年4月I日本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速鉴定致病性香鱼假单胞菌的多重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸混合物、重蒸水以及假单胞菌、香鱼假单胞菌、致病性香鱼假单胞菌的引物对；其中，假单胞菌RNA聚合酶亚单位gyrB的上下游引物为：P1:5’CAACTCSGGCGTTGGCATYCTGCT3’；P2:5’CARG ATCGCCTGGGTRCGACGGTT3’；香鱼假单胞菌gyrB的上下游引物为：P3:5’CTGCTGAAGGACGAGCGTTC3’；P4:5’GGTCATCTCACGAGCTTTCG3’；致病性香鱼假单胞菌Ⅲ型分泌系统调节因子exsA的上下游引物为：P5:5’TTGCTCAGCGAGATCAAAC3’；P6:5’GCTCATCTATCCAAACCCTC3’。
【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定致病性香鱼假单胞菌的多重PCR检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸混合物、重蒸水以及假单胞菌、香鱼假单胞菌、致病性香鱼假单胞菌的引物对； 其中，假单胞菌RNA聚合酶亚单位gyrB的上下游引物为:Pl:5，CAACTCSGGCGTTGGCATYCTGCT3，；P2:5 ’ CARG ATCGCCTGGGTRCGACGGTT3，； 香鱼假单胞菌gyrB的上下游引物为:P3:5 ’ CTGCTGAAGGACGAGCGTTC3，；P4:5’ GGTCATCTCACGAGCTTTCG3’ ； 致病性香鱼假单胞菌III型分泌系统调节因子exsA的上下游引物为:P5:5，TTGCTCAGCGAGATCAAAC3，；P6:5 ’ GCTCATCTATCCAAACCCTC3，。2.如权利要求1所述的一种快速鉴定致病性香鱼假单胞菌的多重PCR检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒具体由下列试剂组成: TaqDNA聚合酶0.05mLU0XPCR缓冲液0.5mL、脱氧核糖核苷三磷酸混合物0.25mL、重蒸水5mL以及浓度分别为10 μ M的假单胞菌、香鱼假单胞菌、致病性香鱼假单胞菌的引物对200 μ L。3.一种应用如权利要求2所述的试剂盒快速鉴定致病性香鱼假单胞菌的多重PCR检测方...
【专利技术属性】
技术研发人员：毛芝娟，李梅芳，陈吉刚，
申请(专利权)人：浙江万里学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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