黄曲霉特异性单链抗体的制备方法和应用技术

本发明专利技术属于食品有害生物分子检测领域，涉及一种黄曲霉特异单链抗体的制备方法及应用。将黄曲霉菌丝细胞壁蛋白分别免疫鸡和小鼠，提取免疫后的鸡脾脏淋巴细胞的信使RNA，构建鸡源单链抗体文库，通过噬菌体表面展示技术筛选文库后得到了对黄曲霉具有高亲和力的曲霉属特异性单链抗体基因。将该抗体基因亚克隆至碱性磷酸酶蛋白表达载体中并在大肠杆菌中表达纯化，得到融合蛋白和分泌黄曲霉特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞2A8。以单抗为捕获抗体，AfSA4-AP融合蛋白为检测抗体，建立SandWich?ELISA免疫学检测系统可检测作物及储藏植物源产品中黄曲霉污染。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于食品有害生物分子检测领域，涉及一种黄曲霉特异单链抗体的制备方法及应用。将黄曲霉菌丝细胞壁蛋白分别免疫鸡和小鼠，提取免疫后的鸡脾脏淋巴细胞的信使RNA，构建鸡源单链抗体文库，通过噬菌体表面展示技术筛选文库后得到了对黄曲霉具有高亲和力的曲霉属特异性单链抗体基因。将该抗体基因亚克隆至碱性磷酸酶蛋白表达载体中并在大肠杆菌中表达纯化，得到融合蛋白和分泌黄曲霉特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞2A8。以单抗为捕获抗体，AfSA4-AP融合蛋白为检测抗体，建立SandWich?ELISA免疫学检测系统可检测作物及储藏植物源产品中黄曲霉污染。【专利说明】黄曲霉特异性单链抗体的制备方法和应用
本专利技术属于食品有害微生物分子检测
，具体涉及一种黄曲霉特异单链抗体和单克隆抗体的制备方法及其在黄曲霉免疫学检测中的应用。
技术介绍
黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)是广泛分布的产生黄曲霉毒素的丝状真菌,可以侵染花生(Arachis hypogaeaL.)、玉米(Zea maysL.)、棉花 (Gossypium spp.)等引起多种作物的病害,危害粮食和经济作物的生产,造成严重的经济损失。在粮食储减以及食品和词料的加工、运输等环节也及易发生黄曲霉和寄生曲霉的污染，导致黄曲霉毒素的积累，从而严重威胁人畜健康及食品安全。黄曲霉毒素主要有AFB1, AFB2, AFG1, AFG2四种类型，主要由黄曲霉和寄生曲霉产生，在我国华南、华中、华北地区产毒菌株分布较广。黄曲霉毒素是真菌生长过程中的次级代谢产物，具有强烈的急性毒性和强烈的致癌、致畸作应，被国际癌症研究机构(IARC)认定为I类致癌物。此外，黄曲霉菌是仅次于烟曲霉(A.fumigatus)的可引起人畜侵袭性曲霉病的第二大类病原菌，严重危害人畜健康。黄曲霉毒素非常稳定，高温(200°C)处理、紫外照射都不能使其分解，一旦发生污染很难进行除去。因此，快速有效的对黄曲霉、寄生曲霉检测方法对于监测农作物病害发生、 从源头上控制黄曲霉毒素的污染具有重要意义。本专利技术选用的抗原制备菌株是高产毒的黄曲霉囷株。目前对黄曲霉、寄生曲霉的监测方法主要是传统生物学方法(如:传统培养基法)、分子检测(如:PCR)、免疫学检测(如:ELISA)。传统培养基法耗时太长，PCR分子检测方法需要特殊的仪器和器材，需专门提取样品的DNA，样品前处理步骤繁琐，操作人员需要具备专门技能。此外，这些传统检测方法的现场实时监测及检测方法的微型化都受到限制。 酶联免疫吸附法(ELISA)检测具有较高的特异性和灵敏度，样品不需要复杂的前处理，便于微型化操作和进行现场实时监测，不受仪器设备和专业操作人员的限制。ELISA检测中常用的酶标二抗为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)标记的抗体，一般通过化学交联的方法将催化酶标记到抗体上。具有随机反应特点的化学交联过程所产生的交联位点可能会影响抗体与抗原的结合，导致抗体特异性和亲和力下降，`对交联反应的优化和酶标抗体的质量检测也会导致生产成本的提高。利用生物技术得到的单链抗体(scFv)具有单克隆抗体的同质性的特点并且基因编码序列明确，同时可以通过微生物发酵进行大量生产。此外，还可以通过基因工程手段对单链抗体进行改造，可以得到抗体和酶的融合蛋白，这种同时具有抗原识别能力和酶催化活性的双功能蛋白可以极大促进ELISA检测方法的应用。本专利技术通过免疫鸡，在克隆鸡的抗体基因基础上构建了单链抗体噬菌体展示文库，利用噬菌体展示方法对文库进行了筛选之后得到了可以识别黄曲霉和寄生曲霉的单链抗体基因。通过免疫小鼠制备了一株可分泌黄曲霉特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过对单链抗体基因进行基因工程改造得到了 scFv-AP融合蛋白并在大肠杆菌中进行大量表达。该scFv-AP 融合蛋白可以与黄曲霉特异单克隆抗体配套使用在双抗体夹心ELISA检测当中。该检测方法灵敏度高，不需要额外的酶标二抗操作简便迅速，可以应用于农作物种植、粮食储藏、食品和饲料加工等领域中的对黄曲霉和寄生曲霉污染的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，其目的之一在于提供一种黄曲霉特异单链抗体基因，该基因利用噬菌体展示技术从免疫后的鸡源单链抗体文库中获得， 申请人:将该基因命名为AfSA4，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示(长度为756bp)，其编码的蛋白质的氨基酸的序列如序列表SEQ IDNO:2所示。本专利技术的黄曲霉特异单链抗体基因由轻链可变区和重链可变区组成，轻链可变区\由312个核苷酸编码，其核苷酸序列如SEQ IDNO:3 所示(长度为390bp);重链可变区V11由390个核苷酸编码，其核苷酸序列如SEQ IDNO:5 所示(长度为312bp)。本专利技术的目的之二在于提供了一种黄曲霉特异单链抗体蛋白，其蛋白质的序列如 SEQ IDNO:2所示，其轻链可变区\由104个氨基酸编码，序列如SEQ ID NO:4所示；重链可变区V11由130个氨基酸编码，其序列如SEQ ID NO:6所示，轻链可变区和重链可变区由连接肽(GGSSRSSSSGGGGSGGGG)连接。本专利技术的目的之三在于提供了一种黄曲霉特异单链抗体蛋白与碱性磷酸酶的融合基因， 申请人:将其命名为AfSA4-AP，其序列如SEQ IDNO:7所示(长度为2175bp)。本专利技术的目的之四在于提供了一种黄曲霉特异单链抗体蛋白与碱性磷酸酶的融合蛋白，其编码序列如SEQ IDNO:8所示(编码725个氨基酸)。单链抗体和碱性磷酸酶之间通过连接肽(SSGSTSGSGKPGSG EGST)连接。本专利技术的目的之五在于提供了一种能够分泌抗黄曲霉的单克隆抗体杂交瘤细胞株 2A8。本专利技术的目的之六在于提供了一种新型的黄曲霉和寄生曲霉的双抗体夹心酶联免疫检测方法(SandwichELISA)，以单克隆抗体2A8作为捕获抗体，以融合蛋白AfSA4_AP作为检测抗体。具体地，为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案:从黄曲霉菌菌丝细胞壁中提取可溶性细胞壁蛋白(SCWPs)，用细胞壁蛋白免疫来亨母鸡，利用分子克隆的技术和方法构建了鸡源单链抗体噬菌体展示文`库，然后利用噬菌体展示技术筛选得到了高亲和力单链抗体AfSA4，并进一步构建了融合蛋白AfSA4-AP。与此同时，用`细胞壁蛋白免疫的Balb / c小鼠后，利用杂交瘤细胞融合技术筛选得到了抗黄曲霉的单克隆抗体杂交瘤细胞株2A8。单克隆抗体2A8(捕获抗体)和单链抗体融合蛋白 AfSA4-AP (检测抗体)可以配套应用与黄曲霉菌的检测当中。一种黄曲霉特异单链抗体基因，其制备过程如下:从培养的黄曲霉菌丝中制备可溶性细胞壁蛋白SCWPs，然后免疫来亨母鸡，在获得满意抗体效价后提取脾脏和骨髓淋巴细胞的mRNA并逆转录成cDNA，然后从cDNA中经PCR 扩增得到鸡抗体的重链可变区基因(V11)和轻链可变区基因(')片段，以及单链抗体基因 (scFv)。将scFv基因亚克隆至噬菌粒载体pComb3X上，电转化至大肠杆菌XLl-Blue MRF’ 得到单链抗体曬菌体展示文库。单链抗体曬菌体展示文库经过曬菌体展示筛选、表达ELISA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黄曲霉特异单链抗体基因AfSA4，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：廖玉才，薛升，李和平，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：