结核(TB)是重要的健康问题，目前唯一获批的TB疫苗是牛分枝杆菌卡介苗(牛分枝杆菌BCG)。在本发明专利技术中，针对疫苗目的评价了报道为涉及吞噬体成熟抑制的分枝杆菌成分的突变，因为这类突变应导致更好的疫苗抗原加工和呈递。因此，在严格的小鼠模型中作为TB疫苗评价了编码ManLAM帽化α-1，2-甘露糖基转移酶和PI3P磷酸酶SapM的基因中的BCG突变型。与未接种的小鼠相比，接种ManLAM帽化突变体和SapM突变体都导致显著更长的存活，而接种亲本BCG则不然。此外，接种SapM突变体的小鼠存活显著长于接种亲本BCG的小鼠。突变体BCG菌株在巨噬细胞中显示未改变的吞噬、复制、溶酶体共定位和氧化剂活性，且在后者中相似地诱导自噬。此外，在小鼠中的复制和肉芽肿形成未受影响，表明这些疫苗等同于BCG的安全性。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及疫苗领域，最尤其是基于活减毒分枝杆菌属(Mycobacterium)的疫苗。本文中所公开的是基因，当在用于免疫动物，尤其是哺乳动物的分枝杆菌中突变时，其作为针对分枝杆菌属感染的疫苗赋予改善的保护功效，同时不干扰诸如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis) BCG的已知接种菌株的有益特性。这类疫苗对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染尤其适宜。
技术介绍
三分之一的世界人口受TB病原体结核分枝杆菌(M.tb)感染。世界卫生组织估计，全世界每年发生约八百万至一千万新的TB病例，TB发病率目前正不断增加。连同疟疾和HIV-AIDS，TB是死于单一感染因子的前三个原因之一，每年约有两百万例死亡可归因于TB (WHO Report, 2008)。目前唯一获批的疫苗是牛分枝杆菌的减毒株牛分枝杆菌卡介苗 (牛分枝杆菌BCG)，从首次使用它的1921年起，至今已对超过四十亿人施用。在出生时施用时，牛分枝杆菌BCG在10岁以前针对播散性疾病赋予一致而可靠的保护(Rodrigues等，1993)。但是,在青少年和成人中针对肺病赋予的保护更可变(Colditz等，1994)。目前研发改善的预防性TB疫苗的主要途径是以牛分枝杆菌BCG作为初始疫苗(priming vaccine),用修饰的牛分枝杆菌BCG或结核分枝杆菌来改善，然后可能在随后某时间用选择的免疫显性抗原作为蛋白质或病毒载体疫苗来强化(Barker等，2009 ；STOP-TBPartnership, 2009)。在结核的情况下，尘细胞成功吞噬结核分枝杆菌，是感染的主要部位。但是，分枝杆菌干扰吞噬体(phagosomal)成熟，从而使分枝杆菌能够部分逃逸否则可以清除它们的许多免疫机制(50)。结核分枝杆菌胞内生长和存活必需的细菌基因和途径是有吸引力的药物靶点，已提出了这类细菌毒力机制中的几种(13，14)。但是，疑似涉及结核分枝杆菌-宿主相互作用的细菌成分的功能验证需要产生突变体。结核分枝杆菌的缓慢生长和低同源重组效率(39)及在昂贵的高生物安全性实验室中工作的需要阻碍了这些关键实验。这些特征的组合使突变体产生成为非常漫长、麻烦和昂贵的过程。因此，许多研究人员借助不致病的生长快速的分枝杆菌物种来产生突变体，得到并非必然外推至它们生长缓慢的亲戚的结果(24)。就结核分枝杆菌-宿主相互作用的许多方面而言,减毒疫苗株牛分枝杆菌BCG是更可靠，也更安全的模式生物(8，17)。它也生长缓慢，且基因组与结核分枝杆菌极其相似(> 99%)，只是缺乏少数基因组区域，其中RDl基因座主要导致其减毒作用(2，33)。各BCG菌株具有多个缺失，其中只有RDl基因座是所有菌株共有的缺失。应指出，分枝杆菌不寻常的细胞壁是使分枝杆菌能够成功定居它们的宿主的因素之一。细胞壁由与巨噬细胞相互作用的脂质、糖脂和蛋白质的复合体组成(5)。这种胞外被膜的一种成分是脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)，其连同它的前体脂甘露聚糖(LM)和磷脂酰肌醇甘露糖苷(PM) —起非共价锚着至质膜。LAM包含甘露糖基磷脂酰肌醇锚(MPI)、甘露聚糖核心和长的取代阿拉伯聚糖(arabinan)分枝。甘露聚糖主链由具有单残基a-l，2_Manp取代的a _1，6连接的甘露糖单元组成。阿拉伯聚糖聚合物由a-I，5连接的Araf单元组成，且被分枝六聚阿拉伯呋喃糖苷和线性四聚阿拉伯呋喃糖苷取代。这些阿拉伯聚糖侧链的非还原端以帽基序终止。在生长缓慢的致病菌株中，这些基序由I个、2个或3个a-1，2连接的Manp残基组成，二甘露糖苷丰度最高。相反，在不致病的菌株中，通常存在肌醇磷酸帽(耻垢分枝杆菌(M. smegmatis)中的PILAM)或完全无帽(龟分枝杆菌(M. chelonae)中的AraLAM) (7)。已报道了 ManLAM(甘露糖基化脂阿拉伯甘露聚糖)在破坏宿主细胞信号传导途径(18)和阻断宿主巨噬细胞中的吞噬体成熟(15)中发挥作用。LAM由磷脂酰肌醇酯(PI)构成，PI的合成需要二酰基甘油激酶Mb2276的活性(45)。PI 经历由 PimA(Mb2642c)、PimB(Mb0572)、PimC(Mbl785c)和 PimF(Mbl538)催化的一系列连续的a-甘露糖基化(25，26，38，57)。从PI合成ManLAM中的所有甘露糖基化的糖基供体底物是多萜醇磷酸甘露糖，该多萜醇磷酸甘露糖是通过多萜醇磷酸甘露糖合酶ppml (Mb2077c)从GDP甘露糖合成的(19)。此过程中的⑶P甘露糖合成涉及磷酸甘露糖变位酶pmmB(Mb3336) (55)。通过加入21-34个残基的线性a-1，6-甘露糖聚合物来在PM4前体上合成LM。此修饰需要甘露糖基转移酶(mannosyltransferase)Mb2196 (23)。之前的研究显示，Rv2181(Mb2203)是负责将单个a _1，2_Manp残基加至LM/LAM的甘露聚糖核心的甘露糖基转移酶(20)。在后一研究中，在耻垢分枝杆菌中失活对应的同源物导致截短LAM 的产生和LM的缺乏。但是，更近的数据显示，结核分枝杆菌中类似的失活导致产生更低分子量LAM，但不影响LM的合成，揭示了此甘露糖基转移酶在LAM的末端帽化中的作用(24)。LAM通过聚a-l，5_araf链的加入衍生自LM,该链的合成需要embC(4,65)。丝氨酸苏氨酸激酶PknH通过磷酸化转录调节物EmbR来调节embC的转录(59)。线性阿拉伯聚糖分枝进一步被六聚和四聚阿拉伯呋喃糖苷结构取代。LAM的这些非还原阿拉伯聚糖末端在结核分枝杆菌和牛分枝杆菌BCG中帽化至不同的程度，具有I至3个(a-l，2)-Manp残基。涉及此a -I，2-甘露糖帽化的第一个甘露糖基转移酶由Rvl635c及其在牛分枝杆菌BCG中的同源物Mbl661c编码(11)。虽然基因Mbl661c可能负责加入帽的第一个甘露糖残基,但认为甘露糖基转移酶Mb2203加入另外一个或两个甘露糖残基来产生二 -Manp和三-Manp帽化的LAM(24)。影响结核分枝杆菌毒力的其他因子包含脂蛋白信号肽酶LspA(Mbl566) (53)、脂质磷酸酶 SapM(Mb3338) (42)和 Zn 金属蛋白酶 Zmpl (Mb0204c) (35)。结核疫苗领域的大多数工作受这样的理念指导BCG“缺失结核分枝杆菌的某物”，必须将其加回BCG来改善疫苗诱导的保护，或者相反，应将结核分枝杆菌减毒至BCG的低毒力，同时保留其免疫显性抗原。前者的实例是过量表达免疫显性结核分枝杆菌抗原的重组 BCG 菌株(Castanon-Arreola 等，2005 ；Horwitz&Harth, 2003 ;Pym 等，2003),后者的实例是结核分枝杆菌的毒力因子突变体(Copenhaver等,2004)、营养突变体(Sambandamurthy等,2005 ;Sambandamurthy等,2002)或信号转导突变体(Martin等,2006)。此外，寻求巨曬细胞中吞曬体成熟和凋亡的改善诱导(Grode等,2005 ;Hinchey等,2007 ；Sadagopal等，2009 ；Sun等本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.07.28 US 61/229,0621.分枝杆菌，其在选自SapM、对应于牛分枝杆菌中Mbl661c的内源ManLAMa-l，2_甘露糖基转移酶、对应于牛分枝杆菌中Mb2203的内源ManLAM a -1,2-甘露糖基转移酶和对应于牛分枝杆菌中Mb2196的内源LM a-1，6_甘露糖基转移酶的至少ー个内源基因中包含基因工程突变。2.权利要求I的分枝杆菌，其中所述内源SapM基因、对应于Mbl661c基因的ManLAMa -1，2_甘露糖基转移酶、对应于Mb2203基因的ManLAM a -I，2_甘露糖基转移酶或对应于Mb2196基因的内源LM a-I，6-甘露糖基转移酶分别包含SEQ ID NO :1、3、5或7，其连续部分，或与之至少95%、至少98%或至少99%同一的序列；或者分别包含编码NO :2、4、6或8，其连续部分，或与之至少95%、至少98%或至少99%同一的序列的序列。3.权利要求I或2的分枝杆菌，其是结核分枝杆菌复合群的成员。4.权利要求I至3中任一项的分枝杆菌，其是结核分枝杆菌、牛分枝杆菌或牛分枝杆菌卡介苗(BCG)。5.权利要求I至4中任一项的分枝杆菌，其中通过插入诱变来产生所述基因工程突变。6.权利要求I至5中任一项的分枝杆菌，其选自保藏菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：N·卡勒维尔特，A·巴特尼，N·菲斯詹斯，C·许根，
申请(专利权)人：非营利性组织佛兰芒综合大学生物技术研究所，国立比利时根特大学，公共卫生科学研究所，
类型：发明
国别省市：
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