血清白蛋白结合剂制造技术

本发明专利技术涉及包含免疫球蛋白可变结构域的多肽，其以高亲和力与血清白蛋白结合以增加治疗剂和组合物的半衰期，尤其对于包含多特异性免疫球蛋白可变结构域的治疗剂如此。本文中还提供用于产生包含血清白蛋白结合性免疫球蛋白可变结构域的本发明专利技术多肽的方法。

Serum albumin bond

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】血清白蛋白结合剂
本专利技术涉及包含免疫球蛋白可变结构域的多肽，其以高亲和力与血清白蛋白结合以增加治疗剂和组合物的半衰期，尤其对于包含多特异性免疫球蛋白可变结构域的治疗剂。本文中还提供用于产生包含血清白蛋白结合性免疫球蛋白可变结构域的本专利技术多肽的方法。背景正在开发数目日益增长的蛋白质治疗剂，如单克隆抗体、抗体片段和疫苗、激素、生长因子、细胞因子、凝血因子、酶、融合蛋白和其他蛋白质，除了完整抗体和Fc-融合蛋白外，它们当中许多具有低于50kDa的分子质量、由肾过滤和降解作用快速清除，导致血浆半衰期短。为了确保治疗效果，这个缺点要求高且频繁的给药，因而伴随可观的不利副作用，这尤其有损于频繁全身性施用治疗剂(例如，针对糖尿病的胰岛素或患有多发性硬化患者中干扰素药物)的患者。半衰期延长策略的研究日益受到生物技术和制药业注意，原因在于治疗益处以及经济益处明显。因为通过新生Fc受体(FcRn，Brambell受体)的再循环机制(Chaudhury等人,2003；Roopeni和Akilesh,2007)，一些血浆蛋白如血清白蛋白和IgG分子具有2–4周范围内的异乎寻常的长半衰期(Kontermann,2009)。细胞摄取的白蛋白和IgG在早期内体的酸性环境下按pH-依赖性方式与FcRn结合。这种结合使白蛋白和IgG在溶酶体区室中偏转免遭降解并使其重定向到胞质膜，在那里，它们被释放回血浆，原因在于中性pH。这种机制已经开发用来扩展蛋白质的半衰期，例如，通过融合于白蛋白或IgG的Fc区。血清白蛋白也可以通过有能力与白蛋白非共价相互作用的模块，参与半衰期延长。在这些方案中，白蛋白结合性部分与治疗性蛋白缀合或遗传融合。已经使用广泛类型的不同部分，其包括对白蛋白具有内在亲和力的分子，还包括经生成和选择以显示出白蛋白结合活性的其他分子如肽、抗体片段、备选支架和小化学物。驼类(camelid)产生缺少轻链的有功能抗体(Hamers-Casterman等人,1993)，其具有单一N端结构域(VHH，也称作)，在不需要结构域配对的情况下结合抗原。这类VHH带来有意义的治疗可能性，原因在于其尺寸小、稳定性高、易于通过遗传融合修饰和在微生物中生产水平良好。但是，VHH的小尺寸也是一个治疗缺点，因为施用至患者时，它们从循环中快速清除。在另一方面，这也提供了将它们偶联于半衰期延长分子或偶联于特异性药物(例如形成抗体-药物缀合物)或示踪剂的机会。本领域描述了多种偶联方法(例如，尤其适用于单克隆抗体修饰领域)并且这些技术例如着重于分别通过酰化或烷基化，借助伯胺基(赖氨酸残基和N末端)或借助半胱氨酸缀合。在小鼠和大鼠中，血清白蛋白的天然半衰期是大约1.5-2.5天，并且已经显示不同血清白蛋白结合剂表现出可比性的半衰期，即大约2天。一种对小鼠白蛋白特异的与两种拮抗性抗EGFR融合，生成双特异性三价分子，并且将半衰期从1小时增加至44小时，并在动物模型中有效地延迟EGFR-阳性肿瘤生长物(Roovers等人,2007)。然而就临床前研究而言，大鼠的代谢生理学相比小鼠更接近于人类，这使大鼠成为研究药物的药代动力学/药效动力学特征和人体毒理学的更好物种。此外，如与小鼠相比，大鼠的较大尺寸允许复杂的外科操作，并且较大的血液量/CSF和组织允许最佳的实验读出。基因修饰的大鼠模型现在还使得药物疗效和安全性研究成为可能，因而临床前研究中使大鼠比小鼠更有内在转化，以进行相同品系和物种中的安全性研究如功效。如例如Hoefman等人(2015)研究，白蛋白结合物在不同物种如啮齿类、灵长类和人类中的半衰期对功效研究中允许最佳给药和实现所需的暴露量及允许更可靠地预测跨物种暴露量至关重要。因此，显然重要的是，不仅依赖于血清白蛋白结合性蛋白在其治疗目标物种(即人类)中的半衰期，对临床前开发环境下每个目的动物物种中的白蛋白而言也显然重要。将不仅有利的是，找到对人白蛋白有足够高的亲和力的血清白蛋白结合剂或多肽，以扩展治疗性蛋白的半衰期；还将有利的是，鉴定在频繁使用的检验用动物(如啮齿类)中具有最高亲和力或最长半衰期的那些血清白蛋白结合剂，以增加成功率和临床前结果的可转化性。VHH有利于治疗性靶向，这是因为它们作为单价结构物或作为多价或多特异性结构的尺寸小，及它们通过与靶向血清白蛋白抗原的VHH融合，扩展治疗性蛋白半衰期的可能性。血清白蛋白结合性VHH的另一个实例由AblynxN.V.(WO2004/041865和WO2006/122787)提供，其描述了针对血清白蛋白和尤其针对人血清白蛋白的纳米抗体，所述纳米抗体可以连接于其他(治疗性)蛋白质(如一种或多种针对所需靶的其他)，以增加所述(治疗性)蛋白质在患者中的半衰期。从而总而言之，血清白蛋白结合性VHH将令人有兴趣增加治疗性蛋白(也可能是VHH，作为血清白蛋白结合性VHH的融合配偶体)的半衰期，不仅在人类中如此，在试验物种中也如此，以允许在非人灵长类中的更大型研究或随访临床研究之前更广泛地采集临床前数据。这种血清白蛋白结合性VHH将允许更可靠和更易开发新治疗剂。并且，由于还显示VHH作为抗体-药物缀合物可用于例如肿瘤靶向中(Fang等人,2016)，故而以下是想要的：鉴定在不妨碍结合功能情况下可以与血清白蛋白缀合的特定VHH并且理想地鉴定所述两个特征的组合以增进新治疗剂的高效研发。最后，针对治疗性用途待开发的VHH还应当就其生物化学特性而言是合适的。专利技术概述本专利技术涉及产生和表征新的VHH，其结合血清白蛋白并且当突变互补决定区(CDR)之一中存在的糖基化位点时，令人惊讶地保留其血清白蛋白结合亲和力，并且另外展示出极高的大鼠血清白蛋白亲和力。另外，所述新的血清白蛋白结合性VHH具有高的抗体-药物缀合物(ADC)潜力，因为在偶联引入的赖氨酸和缀合物后，尽管在CDR1中产生丝氨酸至赖氨酸突变，保留其血清白蛋白结合亲和力，因此保留体内半衰期延长能力。本专利技术的第一方面涉及包含免疫球蛋白可变结构域(IVD)的多肽，其中所述IVD以高亲和力与血清白蛋白结合，如通过BiolayerInterferometry所测定，其中所述IVD包含遵循共同结构FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的氨基酸序列，并且其中如SA1_S30KVHH(SEQIDNO:4)或其人源化变体(h1至h4：SEQIDNOs:8-11；图5)中存在的CDR1区、CDR2区和CDR3区代表3个互补决定区(CDR)。在图1中，显示根据SA1_S30K的CDR区注释。尤其，依据Chothia、AbM、MacCallum或IMTG法确定所述CDR区。在一个实施方案中，特异性的血清白蛋白亲和力针对人血清白蛋白并且备选地针对大鼠、小鼠和食蟹猴血清白蛋白。在一个实施方案中，多肽包含这样的IVD，其中CDR由针对CDR1的SEQIDNO:1的氨基酸序列；针对CDR2的SEQIDNO:2的氨基酸序列；和针对CDR3的SEQIDNO:3的氨基酸序列限定。在又一个实施方案中，本专利技术多肽包含一种IVD，其中CDR如本文所述那样定义，并且其中FR3区由本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含免疫球蛋白可变结构域的多肽(IVD)，其中所述IVD与血清白蛋白结合，并且其中IVD的氨基酸序列包含以下结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，并且其中3个互补决定区(CDR)选自如SEQ ID NOs:4、8、9、10或11的任意中存在的那些CDR1、CDR2和CDR3区域。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170719 EP 17182200.01.一种包含免疫球蛋白可变结构域的多肽(IVD)，其中所述IVD与血清白蛋白结合，并且其中IVD的氨基酸序列包含以下结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，并且其中3个互补决定区(CDR)选自如SEQIDNOs:4、8、9、10或11的任意中存在的那些CDR1、CDR2和CDR3区域。


2.根据权利要求1所述的多肽，其中CDR1包含SEQIDNO:1，CDR2包含SEQIDNO:2并且CDR3包含SEQIDNO:3。


3.根据权利要求1或2述的多肽，其中框架3(FR3)区的氨基酸序列对应于SEQIDNO:4的FR3序列或对应于SEQIDNO:4的人源化变体的FR3序列，其中位置73和74处的氨基酸(根据Kabat编号)是任何氨基酸，位置78处的氨基酸是V或L，位置79处的氨基酸是H或Y，和/或位置82b处的氨基酸是T或S。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含了包含SEQIDNO:4的氨基酸序列或SEQIDNO:4的人源化变体的IVD。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中FR3氨基酸(根据Kabat编号)在位置79处是Y和/或在位置82b处是S。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含了包含SEQIDNO:4的人源化变体的氨基酸序列的IVD。


7.根据权利要求6所述的多肽，其中SEQIDNO:4的人源化变体是SEQIDNO:8、9、10、11、15、16或17或其其它人源化变体。


8.根据权利要求所述的多肽7，其中所述其它人源化变体包含在以下位置处置换了至少一个附加氨基酸(根据Kabat编号)的SEQIDNO:4、8、9、10、11、15、16或17：在位置1处置换成E或D、在位置5处置换成V、在位置14处置换成P、在位置73处置换成任何氨基酸、在位置74处置换成任何氨基酸、在位置78处置换成L...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·哈桑扎德斯加萨贝，S·肖诺奥赫，E·德普拉，
申请(专利权)人：非营利性组织佛兰芒综合大学生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：比利时;BE