用于治疗细菌感染的手段和方法技术

本发明专利技术涉及非天然存在的抗细菌肽。更特别地，所述肽可以用于治疗多重耐药细菌感染。此外，本发明专利技术提供了用于制备抗细菌肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗细菌感染的手段和方法专利
本专利技术涉及非天然存在的抗细菌肽。更特别地，所述肽可以用于治疗多重耐药细菌感染。此外，本专利技术提供了用于制备抗细菌肽的方法。专利技术介绍对多种药物具有耐药性的微生物引起了人们的极大关注，并且其后果对于特别容易受到细菌感染的儿童而言可能是最深远的影响。发展中国家最常见的儿童细菌性疾病-肺炎、其它呼吸道感染和痢疾-已不再可以通过许多较旧的抗生素治愈。其后果是灾难性的：例如，细菌性急性呼吸道感染每年导致超过300万儿童死亡。这些疾病的许多情况是由现在对普通抗生素具有抗性的菌株引起的。在较富裕的国家中，医院对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(MRSA)的爆发感到震惊。从1974年到2004年，在许多美国医院中，MRSA的患病率从葡萄球菌感染的大约2％上升到50％以上，导致数万人死亡。对抗生素的耐药性也对治愈患者的费用产生了惊人的影响。在许多贫困国家中，药品支出占整体卫生保健费用的很大一部分，占卫生总支出的20-60％。当一线药物失败时，二线替代药物几乎总是昂贵得多，并且需要更大的医疗监督。例如，治愈一名广泛耐药TB患者的费用与治愈200名易感TB患者的费用相同。除了已知的病原体之外，对许多药物具有内在抗性的机会性生物体的相对较新出现也使医学技术的发展变得复杂。随着更大量免疫功能低下的患者和更长的时间处于免疫功能低下的状态，几种生物体已成为“特殊”病原体-典型地仅攻击最脆弱的患者。在这些机会性病原体中有肠球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumanii)。在本专利技术中，我们公开了一种新的设计者的抗生素范例，其利用蛋白质聚集通过广泛的蛋白静止性崩溃杀死细菌。由于体内高度拥挤的胞内环境使非常靠近的许多种类的多肽需要进行容易出错的折叠反应才能获得其天然构象2，因此蛋白质稳态或蛋白稳态损失1对于任何活细胞都是一个持续的威胁。为了控制这种威胁，细胞进化出了由分子伴侣、蛋白酶和其它特殊分子组成的复杂网状结构3。尽管该机制的基本组成在所有生命王国中都是保守的，但与在真核细胞中观察到的更为复杂的版本相比4，细菌具有相对简单的蛋白稳态网状结构。尽管存在这些细胞应答机制，但人类蛋白质折叠病理学已经清楚表明，在持续暴露于聚集蛋白质的情况下，例如突变的结果是，蛋白稳态网状结构最终分解，最终导致细胞死亡5。另一方面，蛋白质聚集被证明是高度有序并且特定的过程：聚集在相似多肽之间比在无关多肽之间更有效6-8。在机械论水平上，蛋白聚集是由短聚集倾向序列片段(称为APR)介导的，该片段在一级多肽序列中平均大约每100个氨基酸发生一次。这些APR通常是(但并非总是)构成球形蛋白或蛋白-蛋白相互作用界面的疏水核心的序列区段。令人遗憾地，提供这些三级蛋白质相互作用模式的物理化学要求也有利于蛋白质聚集9。实际上，在(部分)未折叠的蛋白质中，在形成天然蛋白质最稳定的部分时，APR也可以与来自另一种蛋白质的相同APR进行自组装，以形成甚至更稳定的β结构聚集体10。因此，在蛋白质获得其天然构象之前，聚集的风险在翻译过程中最高11。总体而言，细菌蛋白质组比高级生物体显示出更高的内在聚集敏感性14。另外，细菌中的蛋白质转换需要更快以支持其高代谢和细胞分裂速率，这进一步增加了细菌中蛋白质聚集的可能性。越来越多地研究细菌蛋白稳态作为新抗生素的药物靶标15。例如，抗微生物肽(AMP)oncocin通过结合到核糖体出口通道发挥其抗细菌活性16。有意义的是，肽的淀粉样蛋白形成倾向与其抗细菌活性之间存在明显的重叠17,18，并且我们预先观察到，源自革兰氏阳性表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)聚集蛋白质片段的肽可能对这些细菌有特异性毒性19。蛋白质聚集是一种序列特异性过程，它使蛋白质可以模板化其自身的聚集，但不能模板化异源序列。我们以前利用此特征在WesternBlot8中进行特异性蛋白质检测，或使用靶蛋白质的短聚集倾向序列片段(APR)诱导特异性蛋白质敲除。使用融合到目标APR的转基因GFP载体，我们在拟南芥(Arabidopsisthaliana)和玉米(Zeamays)中产生了特异性功能丧失表型，分别导致植物大小增加和淀粉含量增加21。我们还发现有可能使用合成肽达到相同的效果，并且最近设计了一种名为vascin的肽，该肽被人细胞内化，并且通过聚集特异性诱导VEGFR-2失活。此外，在同基因鼠模型中，vascin在体内具有抑制VEGFR-2依赖性肿瘤生长的活性47。近来，我们还研究了具有革兰氏阳性葡萄球菌内源性APR的合成肽是否可以在体外诱导聚集相关的细菌死亡，并且发现了几种在体内对MRSA有活性的肽19。专利技术概述鉴于抗细菌药耐药性迅速增加的问题，尤其是在革兰氏阴性细菌中，我们在这里着手开发对抗肠出血性大肠杆菌(E.coli)菌株O157:H7的新抗微生物肽，该菌株产生高水平的毒素，导致感染时出血性腹泻和肾衰竭20。假设对具有多个靶标的药物更难产生耐药性，我们寻找可以引起多种细菌蛋白质错误折叠或聚集的肽。为此，我们筛选了125个在大肠杆菌蛋白质组中具有高度丰余性的聚集序列。以这种方式，一种含有该APR的肽可以潜在地影响许多含有高度相似的APR的蛋白质的折叠。使用这种策略，我们鉴定了几种在致病性大肠杆菌中有效诱导杀细菌蛋白质聚集和包涵体形成的肽。这些的一个代表-在本文中进一步命名为colpeptin1-对哺乳动物细胞几乎没有毒性或无毒性，并且还对许多其它细菌病原体具有活性(参见表2)，并且在小鼠膀胱感染模型中对大肠杆菌具有体内有效作用。我们证明了非天然肽(例如colpeptin1)的内化，然后是通过主要的colpeptin1靶标促进的多种蛋白质的快速聚集级联，从而导致细菌蛋白稳态崩解。附图图1：抗细菌聚集肽的活性、细胞毒性和聚集。(A)在MIC浓度(3次重复的平均值和s.d.)下处理的对抗大肠杆菌菌株O157的所选肽的时间-杀死曲线。(B、C、D)包埋入树脂中的大肠杆菌O157的横截面的透射电子显微胶片(TEM)。B为模拟物处理的，C为P2处理的大肠杆菌O157(2小时)并且D为P105处理的大肠杆菌O157(2小时)。(E)通过监测在亚致死剂量的肽或氨苄西林(MIC的50％)下维持36天的培养物的MIC值来监测耐药性的自发建立。(F)所选肽对人红细胞的浓度依赖性溶血作用(3次重复的平均值和s.d.)。(G)通过CellTiterBlue测定法(3次重复的平均值和s.d.)和(H)通过LDH释放测定法(3次重复的平均值和s.d.)测定的Colpeptin1对人HeLa细胞的细胞毒性。(I)在50mMMES缓冲液pH7中将单体稀释至最终肽浓度为100μM后两分钟，显示了colpeptin1单体(1)到九聚体(9)的ESI-IMS-MSDriftscope图。ESI–IMS–MSDriftscope图显示了IMS迁移时间与质/荷(m/z)与强度(z，平方根标度)的关系。数据来自单个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.非天然存在的抗细菌肽，其被装配成诱导细菌的一种或多种主要靶蛋白聚集，以便形成包涵体，其包含所述细菌中的所述一种或多种主要靶蛋白，其中所述细菌的一种或多种主要靶蛋白包括3-苯丙酸-二氢二醇/肉桂酸-二氢二醇脱氢酶(Hcab)蛋白。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170509 EP 17170233.5;20170509 EP 17170252.51.非天然存在的抗细菌肽，其被装配成诱导细菌的一种或多种主要靶蛋白聚集，以便形成包涵体，其包含所述细菌中的所述一种或多种主要靶蛋白，其中所述细菌的一种或多种主要靶蛋白包括3-苯丙酸-二氢二醇/肉桂酸-二氢二醇脱氢酶(Hcab)蛋白。


2.权利要求1的肽，其中所述细菌的一种或多种主要靶蛋白还包括：
-伴侣蛋白skp(Skp)、磷酸调节子传感蛋白(PhoR)、二肽和三肽通透酶A(Dtpa)、可能的传感器样组氨酸激酶YedV(YedV)、未表征的Na(+)/H(+)交换剂YjcE(YjcE)、渗透性传感蛋白EnvZ(EnvZ)、传感蛋白RstB(RstB)、传感蛋白ZraS(ZraS)、推定的未表征的蛋白YbfO(YbfO),传感组氨酸激酶DcuS(DcuS)、信号转导组氨酸-蛋白激酶AtoS(AtoS)、甲酸脱氢酶亚单位4(hycD)、芳族氨基酸输出物YddG(YddG)、UPF0226蛋白YfcJ(YfcJ)和内膜蛋白yfeZ(YfeZ)；
-选自表8中列出的蛋白的一种或多种蛋白；和/或
-选自表9中列出的蛋白的一种或多种蛋白。


3.权利要求1或2的肽，其中该肽通过与所述一种或多种主要靶蛋白中的一个或多个聚集倾向区域(APR)共聚集诱导所述细菌的所述一种或多种主要靶蛋白聚集。


4.权利要求3的肽，其中所述一个或多个APR的氨基酸序列为GLGLALV(SEQIDNO:128)或与GLGLALV(SEQIDNO:128)相比展示出单一错配。


5.权利要求3或4的肽，其中该肽通过与一个或多个APR共聚集诱导所述细菌的所述一种或多种主要靶蛋白聚集，所述APR选自：GLGLALV(SEQIDNO:128)、GLGLALA(SEQIDNO:202)、GLGLAIV(SEQIDNO:203)、GLGLAMV(SEQIDNO:204)、GLGLSLV(SEQIDNO:205)、GLALALV(SEQIDNO:206)、GLGLAVV(SEQIDNO:207)、GLPLALV(SEQIDNO:208),GVGLALV(SEQIDNO:209)、GLGLALS(SEQIDNO:210)、GLLLALV(SEQIDNO:211)、GLGLALQ(SEQIDNO:212)、GIGLALV(SEQIDNO:213)。


6.权利要求1-5任一项的肽，其中细菌为革兰氏阴性菌，优选埃希氏菌属或不动杆菌属，更优选大肠杆菌、抗辐射不动杆菌或鲍氏不动杆菌。


7.权利要求1-6任一项的肽，其中该肽表现出对抗所述细菌小于32μg/mL、例如25μg/mL或以下、12μg/mL或以下或6μg/mL或以下的最低抑制浓度(MIC)。


8.权利要求1-7任一项的肽，其中该肽包含序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7，其被装配成与所述一个或多个APR共聚集，其中：
-X1为甘氨酸或甘氨酸的保守氨基酸取代或甘氨酸的非天然氨基酸变体或甘氨酸的保守氨基酸取代的D-氨基酸或甘氨酸的非天然氨基酸变体的D-氨基酸，
-X2为亮氨酸或亮氨酸的保守氨基酸取代或亮氨酸的非天然氨基酸变体或亮氨酸的D-氨基酸或亮氨酸的保守氨基酸取代的D-氨基酸或亮氨酸的非天然氨基酸变体的D-氨基酸，
-X3为甘氨酸或甘氨酸的保守氨基酸取代或甘氨酸的非天然氨基酸变体或甘氨酸的保守氨基酸取代的D-氨基酸或甘氨酸的非天然氨基酸变体的D-氨基酸，
-X4为亮氨酸或亮氨酸的保守氨基酸取代或亮氨酸的非天然氨基酸变体或亮氨酸的D-氨基酸或亮氨酸的保守氨基酸取代的D-氨基酸或亮氨酸的非天然氨基酸变体的D-氨基酸，
-X5为丙氨酸或丙氨酸的保守氨基酸取代或丙氨酸的非天然氨基酸变体或丙氨酸的D-氨基酸或丙氨酸的保守氨基酸取代的D-氨基酸或丙氨酸的非天然氨基酸变体的D-氨基酸，
-X6为亮氨酸或亮氨酸的保守氨基酸取代或亮氨酸的非天然氨基酸变体或亮氨酸的D-氨基酸或亮氨酸的保守氨基酸取代的D-氨基酸或亮氨酸的非天然氨基酸变体的D-氨基酸，并且
-X7为缬氨酸或缬氨酸的保守氨基酸取代或缬氨酸的非天然氨基酸变体或缬氨酸的D-氨基酸或缬氨酸的保守氨基酸取代的D-氨基酸或缬氨酸的非天然氨基酸变体的D-氨基酸。


9.权利要求1-8任一项的肽，其包含一个或多个D-氨基酸和/或非天然氨基酸。


10.权利要求1-9任一项的肽，其包含如下结构：(A2i-1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-A2i-Zi)n，其中：
-n为1-4的整数，并且i在每次重复时从1增加至n；
-A2i-1和A2i各自独立地选自1-3个连续的看门物，其中肽结构中的氨基-末端看门物任选被乙酰化，和/或其中肽序列中的羧基-末端看门物任选被酰胺化，
-X1为甘氨酸或甘氨酸的保守氨基酸取代或甘氨酸的非天然氨基酸变体或甘氨酸的保守氨基酸取代的D-氨基酸或甘氨酸的非天然氨基酸变体的D-氨基酸，
-X2为亮氨酸或亮氨酸的保守氨基酸取代或亮氨酸的非天然氨基酸变体或亮氨酸的D-氨基酸或亮氨酸的保守氨基酸取代的D-氨基酸或亮氨酸的非天然氨基酸变体的D-氨基酸，
-X3为甘氨酸或甘氨酸的保守氨基酸取代或甘氨酸的非天然氨基酸变体或甘氨酸的保守氨基酸取代的D-氨基酸或甘氨酸的非天然氨基酸变体的D-氨基酸，
-X4为亮氨酸或亮氨酸的保守氨基酸取代或亮氨酸的非天然氨基酸变体或亮氨酸的D-氨基酸或亮氨酸的保守氨基酸取代的D-氨基酸或亮氨酸的非天然氨基酸变体的D-氨基酸，
-X5为丙氨酸或丙氨酸的保守氨基酸取代或丙氨酸的非天然氨基酸变体或丙氨酸的D-氨基酸或丙氨酸的保守氨基酸取代的D-氨基酸或丙氨酸的非天然氨基酸变体的D-氨基酸，
-X6为亮氨酸或亮氨酸的保守氨基酸取代或亮氨酸的非天然氨基酸变体或亮氨酸的D-氨基酸或亮氨酸的保守氨基酸取代的D-氨基酸或亮氨酸的非天然氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·希姆科维兹，F·卢梭，
申请(专利权)人：非营利性组织佛兰芒综合大学生物技术研究所，天主教鲁汶大学研究发展中心，
类型：发明
国别省市：比利时;BE