单分子肽测序的手段和方法技术

本发明专利技术涉及生物化学领域，更特别地涉及蛋白质组学，更特别地涉及蛋白质测序，甚至更特别地涉及单分子肽测序。本发明专利技术公开了使用裂解诱导剂进行单分子蛋白质测序和/或氨基酸鉴定的手段和方法。所述裂解诱导剂不是对一种特定氨基酸是特异性的，其从N末端开始逐步裂解多肽，并基于所述反应的动力学来提供关于裂解的氨基酸的身份的信息。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】单分子肽测序的手段和方法专利
本专利技术涉及生物化学领域，更特别地涉及蛋白质组学，更特别地涉及蛋白质测序，甚至更特别地涉及单分子肽测序。本专利技术公开了使用裂解诱导剂进行单分子蛋白质测序和/或氨基酸鉴定的手段和方法。所述不是对一种特定氨基酸特异性的裂解诱导剂，从N末端开始逐步裂解多肽，并基于所述裂解诱导剂与多肽之间的啮合(engagement)动力学或所述多肽裂解反应的动力学来提供关于裂解的氨基酸的身份的信息。背景生物分子(DNA、RNA、蛋白质)的高通量测序技术正在迅速发展，并且对于现代科学和医学至关重要。尤其是DNA测序技术已经取得了巨大飞跃，目前已从二代技术发展到作用于单分子水平的第三代方法(例如PacificBiosciences，OxfordNanopores；Ambardar等，2016IndianJMicrobiol56：394-404)。DNA的均匀性质和广泛的可用分子工具组确实推动了该领域的发展。相比之下，蛋白质/肽的测序相对滞后，并且很大程度上依赖于基于液相色谱-质谱(LC-MS)的技术。尽管LC-MS仪器在速度、灵敏度和分辨率方面已取得了很大进步，但操作和维护机器却非常复杂且昂贵。此外，基于MS的蛋白质组学仍然需要大约106个拷贝的蛋白质/肽才能被检测到。目前无法进行单蛋白质/肽测序，因此无法实现如单细胞蛋白质组学这样的应用。此外，由于蛋白质无法像DNA一样进行扩增，因此单分子测序从概念上讲是更好的选择，而且可以进一步对蛋白质进行数字量化。下一代蛋白质测序的概念正在萌芽，但面临重大挑战。首先，要区分二十种氨基酸(相比之下，只有四种核苷酸)，并且获得单个可测量参数以严格识别每种氨基酸似乎不太可能。然而，甚至通过概率方式能够将某个氨基酸类别归因于每个序列位置，对于通过基于约束的肽识别从数据库进行剖析(如针对LC-MS数据所做的那样)，可能就已经足够了(Swaminathan等。2015PLoSComputBiol.11：e1004080)。其次，就理化性质而言，蛋白质极不均一。通过应用自下而上的蛋白质组学方法，即通过蛋白酶介导的蛋白质组消化成肽，可以在一定程度上减少这种情况。动态范围为几个数量级的这种复杂的肽混合物的并行测序将不可避免地面临巨大的技术障碍。通过从肽库中纯化(蛋白型)肽的子集，可以进一步降低复杂性。通过(固态)纳米孔的肽测序是目前研究中最受欢迎的平台。对纳米孔的工程化进行了广泛的研究，这些工程化能够转运肽并沿序列区分氨基酸或氨基酸类别(Kennedy等2016NatNanotechnol11：968-976；Wilson等2016AdvFunctMater26：4830-4838)。Mitra等(WO2010/065531)开发了另一种有希望的以灵敏和定量的方式分析蛋白质的技术。这项技术被称为通过末端测序的蛋白质数字分析或DAPES，其特征是一种用于单分子蛋白质分析的方法。为了进行DAPES，将大量蛋白质变性并裂解成肽。将这些肽固定在应用于显微镜载玻片表面的纳米凝胶表面上，并使用涉及Edman降解的方法并行测定其氨基酸序列。将异硫氰酸苯酯(PITC)添加到载玻片中，并与每种肽的N端氨基酸反应形成稳定的苯硫脲衍生物。接着，通过例如用每个PITC衍生的N末端氨基酸特异性的抗体进行20轮抗体结合、检测和剥离来确定N末端氨基酸衍生物的身份。通过升高温度或降低pH值来去除N末端氨基酸，并重复该循环以从载玻片上的每个肽中测序12-20个氨基酸。然后可以根据观察到的不同肽序列的数量来计算原始样品中每种蛋白质的绝对浓度。DAPES中使用的PITC化学性质与Edman降解中使用的相同，并且高效且耐用(效率>99％)。然而，单个氨基酸的裂解需要强的无水酸，或替换地，高温水性缓冲液。对于用于单分子蛋白质检测(SMD)的敏感底物上的多轮分析，不希望在这些严酷条件中的任一个之间进行循环。替代的肽测序方法使用N末端氨基酸结合蛋白(NAAB)代替结合PITC衍生的N末端氨基酸的抗体(WO20140273004)。对于每种氨基酸，研发了可以由氨肽酶或tRNA合成酶修饰的NAAB。NAAB被不同地标记，然后通过在孵育和洗涤此类NAAB时检测与N末端氨基酸结合的特定NAAB的荧光标记来鉴定多肽的N末端氨基酸。此外，代替化学/物理去除N末端氨基酸，可以使用称为Edmanase的酶(以Edman降解命名)。尽管Edmanase解决了Mitra等的局限性，但这种方法依赖于NAAB的库来推导氨基酸身份信息。所有不同氨基酸的NAAB应一起存在或顺序添加，从而增加了该系统的复杂性。此外，研发具有足够亲和力的以用于单分子感测中的NAAB的能力仍未被证实。因此，与仅基于试剂的结合亲和力相比，基于不同的理化原理研发更简单且更精细的蛋白质测序技术将是有利的。概述在此，描述了替代的单分子肽测序方法和其中涉及的工程化分子。使用氨肽酶的催化特性和酶促反应的动力学来鉴定(或分类)肽单分子的N末端氨基酸。本申请中描述的方法基于工程化的氨肽酶的周转数(kcat)与其裂解的N端氨基酸之间的相关性。因此，通过测量N-末端氨基酸被切除之前，工程化氨肽酶在添加到肽底物上后停留的时间，可以鉴定出N-末端氨基酸。所述氨肽酶也可以被化学裂解诱导剂代替。与使用氨肽酶所观察到的相似，化学裂解诱导剂的停留时间是对其结合的N端氨基酸身份的读出。更准确地说，本申请提供了一种对蛋白质进行测序的方法，该方法包括以下步骤循环：通过肽C-末端部分与易裂键固定的肽的N-末端衍生，测量裂解诱导剂切除N末端氨基酸导致N末端氨基酸从固定化表面释放所花费的时间，使系统为下一个循环做好准备(图1)。裂解诱导剂可以是催化活性的氨肽酶或异硫氰酸酯样化学物质。在第一个方面中，提供了工程化的、作用于多肽的催化活性氨肽酶，其中所述多肽通过其C末端或通过所述多肽的第一肽键的C末端肽部分固定在表面上，其中所述氨肽酶裂解所述多肽的N-末端氨基酸，并且其中所述氨肽酶在裂解所述N-末端氨基酸之前的停留时间鉴定或分类所述N-末端氨基酸。所述N-末端氨基酸可以是衍生的N-末端氨基酸，并且如果这样，则所述氨肽酶结合并裂解所述衍生的N-末端氨基酸。所述N末端氨基酸可以是用异硫氰酸酯或异硫氰酸酯类似物衍生的N末端氨基酸。更特别地，上述氨肽酶是与SEQIDNo.1或SEQIDNo.2具有至少80％序列同一性并且具有25位的甘氨酸残基，65位的丝氨酸残基，138位的半胱氨酸残基和208位的组氨酸残基的氨肽酶，所述氨肽酶能够结合用CITC或SPITC衍生的N端氨基酸。更具体地讲，氨肽酶包含如SEQIDNo.3或SEQIDNo.4中所示的氨基酸序列。本申请所述的氨肽酶还可以与SEQIDNo.7具有至少80％序列同一性，其中半胱氨酸残基插入第1位的甲硫氨酸残基和第2位的丙氨酸残基之间。更特别地，所述氨肽酶包含SEQIDNo.8或由SEQIDNo.8组成。在特别的实施方案中，以上氨肽酶进一步包含光学、电学或等离子体标记，因此可以通过光学、电学或等离子体检测所述氨肽酶。在其他特别的实施方案中，所述氨肽酶是嗜热的和/或耐溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种作用于多肽的工程化的、催化活性氨肽酶，其中所述多肽通过其C-末端或通过所述多肽的第一个肽键的C-末端肽部分固定于表面上，其中所述氨肽酶裂解所述多肽的N-末端氨基酸，和其中所述氨肽酶直至所述N-末端氨基酸裂解的停留时间鉴定或分类所述N-末端氨基酸。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170928 GB 1715684.51.一种作用于多肽的工程化的、催化活性氨肽酶，其中所述多肽通过其C-末端或通过所述多肽的第一个肽键的C-末端肽部分固定于表面上，其中所述氨肽酶裂解所述多肽的N-末端氨基酸，和其中所述氨肽酶直至所述N-末端氨基酸裂解的停留时间鉴定或分类所述N-末端氨基酸。


2.权利要求1的氨肽酶，其中所述N-末端氨基酸是衍生的N-末端氨基酸，并且其中所述氨肽酶结合并裂解所述衍生的N-末端氨基酸。


3.权利要求2的氨肽酶，其中所述N-末端氨基酸是用异硫氰酸酯或异硫氰酸酯类似物衍生的N-末端氨基酸。


4.权利要求1-3任一项的氨肽酶，其中所述N-末端氨基酸是用CITC或SPITC衍生的，并且所述氨肽酶与SEQIDNo.1或SEQIDNo.2具有至少80％序列同一性并且具有25位的甘氨酸残基，65位的丝氨酸残基，138位的半胱氨酸残基和208位的组氨酸残基。


5.权利要求4的氨肽酶，包含SEQIDNo.3或SEQIDNo.4中所示的氨基酸序列。


6.权利要求1的氨肽酶，其中所述氨肽酶与SEQIDNo.7具有至少80％序列同一性，其中在1位的甲硫氨酸残基和2位的丙氨酸残基之间插入半胱氨酸残基。


7.权利要求6的氨肽酶，其包含SEQIDNo.8或由SEQIDNo.8组成。


8.权利要求1-7任一项的氨肽酶，其进一步包含光学、电学或等离子体标记，或其中通过光学、电学或等离子体来检测所述氨肽酶。


9.权利要求1-8任一项的氨肽酶，其中所述氨肽酶是嗜热和/或耐溶剂的。


10.裂解诱导剂获得多肽的序列信息的用途，所述多肽通过其C-末端或通过所述多肽的第一个肽键的C-末端肽部分固定于表面上，其中所述裂解诱导剂在所述多肽的N-末端氨基酸上的停留时间鉴定或分类所述N-末端氨基酸。


11.根据权利要求10的用途，其中所述裂解诱导剂是催化活性的氨肽酶、异硫氰酸酯或异硫氰酸酯类似物。


12.根据权利要求11的用途，其中所述催化活性的氨肽酶是权利要求1或6-9任一项的氨肽酶，和其中N-末端氨基酸选自Leu、Met、Tyr、Arg、Pro、Gly、Lys、Ala和Val。


13.根据权利要求11的用途，其中所述催化活性的氨肽酶是权利要求2的氨肽酶，和其中所述衍生的末端氨基酸是衍生的N-末端氨基酸。


14.根据权利要求13的用途，其中所述衍生的N-末端氨基酸是用CITC或SPITC衍生的，和其中所述氨肽酶是权利要求4、5、8或9任一项的氨肽酶。


15.权利要求10-14任一项的用途，其中在单分子水平获得所述多肽的所述序列信息。


16.一种鉴定或分类多肽的N-末端氨基酸的方法，所述多肽通过其C-末端或通过所述多肽的第一个肽键的C-末端肽部分固定于表面上，所述方法包括：
a)将所述表面固定的多肽接触裂解诱导剂，其中所述裂解诱导剂结合并裂解所述多肽的N-末端氨基酸；
b)测量所述裂解诱导剂在所述N-末端氨基酸上的停留时间；
c)将所述测量的停留时间与所述裂解诱导...

【专利技术属性】
技术研发人员：N·卡勒维尔特，S·艾克曼，S·德沃斯，
申请(专利权)人：非营利性组织佛兰芒综合大学生物技术研究所，国立比利时根特大学，
类型：发明
国别省市：比利时;BE