一种靶向肺癌的偶联药物cdGIGPQc‑ScFvαvβ3制造技术

本发明专利技术公开了一种靶向肺癌的偶联药物cdGIGPQc‑ ScFvαvβ3，是小分子肽cdGIGPQc和整合素αvβ3的单链抗体ScFvαvβ3通过偶联得到。本发明专利技术的偶联药物cdGIGPQc‑ScFvαvβ3是小分子，容易透过毛细血管，能迅速在肺癌靶细胞集聚；无免疫原性，不会产生抗‑抗体，不存在过敏的危险，安全性好；体内清除快，对机体无毒副作用。cdGIGPQc‑ScFvαvβ3对非小细胞肺癌的靶向性强，小分子肽能与体内任何部位的非小细胞肺癌细胞发生特异性的结合，疗效不受肿瘤的生长部位的限制，更适合于远处器官转移的晚期肺癌患者。

A targeted lung cancer drug conjugates cdGIGPQc ScFv alpha v beta 3

The invention discloses a targeted lung cancer drug conjugates cdGIGPQc ScFv alpha v beta 3, is a small molecular peptide cdGIGPQc and integrin alpha v beta 3 scFv ScFv alpha v beta 3 obtained by coupling. The invention of the cdGIGPQc drug conjugates ScFv alpha v beta 3 is a small molecule, easily through the capillaries, can quickly accumulate in lung cancer cells; no immunogenicity, no anti antibody does not exist the risk of allergies, good safety; rapid clearance, non-toxic side effects on the body. Strong targeting cdGIGPQc ScFv alpha v beta 3 in non-small cell lung cancer, with small molecular peptide and any parts of the body in non small cell lung cancer cell specificity, efficacy is not affected by the growth of tumors in the limit, more suitable for distant metastasis in patients with advanced lung cancer.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种靶向肺癌的偶联药物cdGIGPQc-ScFvαvβ3。
技术介绍
肺癌是世界范围内最常见、致死人数最多的恶性肿瘤之一，其发病率增长速度亦高居各恶性肿瘤之首。目前肺癌的主要治疗模式还是多学科的综合治疗，但总体效果不尽人意。分子靶向治疗已成为当今肺癌临床治疗学的重要研究课题之一。分子靶向治疗，是指在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点(该位点可以是肿瘤细胞的一个蛋白分子，也可以是一个基因片段)，来设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞。研究证实整合素αvβ3在肺癌等病理性血管生成的过程中发挥了重要的作用，而新生血管的形成是肿瘤侵袭和转移的标志。因此以整合素αvβ3为靶点，抑制肿瘤血管生成，使肿瘤细胞无法得到所需的血液、氧和其它养分，从而促进了细胞凋亡。针对αvβ3的单克隆抗体新药已进入临床试验阶段，然而由于单克隆抗体分子较大，难以进入实体瘤内部；体内清除慢，易产生抗-抗体，副作用较大等缺点，因而研发更易透过毛细血管，能进入实体肿瘤内部的小分子肿瘤抑制剂具有重大意义。本专利技术是利用单链抗体(scFvαvβ3)替代上述单克隆抗体，并将小分子肽cdGIGPQc和整合素αvβ3单链抗体ScFvαvβ3结合起来，得到靶向肺癌的偶联药物cdGIGPQc-ScFvαvβ3来解决上述问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种靶向肺癌的偶联药物cdGIGPQc-ScFvαvβ3。本专利技术所采取的技术方案是：一种靶向肺癌的偶联药物，是小分子肽cdGIGPQc和整合素αvβ3的单链抗体ScFvαvβ3通过偶联得到，记名为cdGIGPQc-ScFvαvβ3。优选的，小分子肽cdGIGPQc中，c表示D型半胱氨酸，d表示D型天冬氨酸，G表示L型甘氨酸，I代表L型异亮氨酸，P代表L型脯氨酸，Q代表L型谷氨酰胺。优选的，整合素αvβ3单链抗体ScFvαvβ3的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。优选的，编码整合素αvβ3单链抗体ScFvαvβ3的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。优选的，所述肺癌为非小细胞肺癌。偶联药物cdGIGPQc-ScFvαvβ3在制备治疗癌症药物中的应用。优选的，所述癌症为肺癌。优选的，所述肺癌为非小细胞肺癌。本专利技术的有益效果是：本专利技术利用整合素αvβ3的单链抗体(scFvαvβ3)替代单克隆抗体。本专利技术中整合素αvβ3的单链抗体是把单克隆抗体重链的可变区(VH)和轻链的可变区(VL)基因在DNA水平克隆出来，再用一段连接肽(GGGGS)3的基因把VH和VL的羧基端和氨基端以VH-linker-VL的形式连接起来，表达后即得到单链抗体ScFvαvβ3片段，记名为ScFvαvβ3。此外，利用小分子肽cdGIGPQc与整合素αvβ3单链抗体ScFvαvβ3进行偶联，得到靶向肺癌的偶联药物cdGIGPQc-ScFvαvβ3。本专利技术所获得的偶联药物cdGIGPQc-ScFvαvβ3是小分子，容易透过毛细血管，能迅速在肺癌靶细胞集聚；cdGIGPQc和ScFvαvβ3无免疫原性，不会产生抗-抗体，不存在过敏的危险，安全性好；体内清除快，对机体无毒副作用；cdGIGPQc-ScFvαvβ3对非小细胞肺癌的靶向性强，小分子肽能与体内任何部位的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞发生特异性的结合，疗效不受肿瘤的生长部位的限制，更适合于远处器官转移的晚期肺癌患者，而对正常细胞无影响。本专利技术所获得的偶联药物cdGIGPQc-ScFvαvβ3对肺癌移植瘤的抑制率约为ScFvαvβ3和cNAQAEQc-ScFvαvβ3的1.40倍和1.56倍，也优于αvβ3单克隆抗体(mAb)。附图说明图1为小分子肽cdGIGPQc的合成及分析；图2为小分子肽cNAQAEQc的合成及分析；图3为ScFvαvβ3蛋白的表达与纯化；图4为体外分析cdGIGPQc-ScFvαvβ3和cNAQAEQc-ScFvαvβ3对肺癌细胞的结合能力；图5为cdGIGPQc-ScFvαvβ3体外的抗原结合能力及肿瘤生长抑制作用；图6为cdGIGPQc-ScFvαvβ3的体内抗肿瘤疗效；图7为H&E染色和免疫组化结果；图8为A549动物移植瘤模型经治疗后重要脏器的H&E染色；图9为L78动物移植瘤模型经治疗后重要脏器的H&E染色。具体实施方式本专利技术的技术方案是：(1)、cdGIGPQc-ScFvαvβ3的设计和合成专利技术人利用PCR方法及分子生物学基因克隆技术，构建cdGIGPQc-ScFvαvβ3，初步阐明其对肺癌细胞增殖和转移的影响。(2)、小分子肽-ScFvαvβ3的靶向性分析将荧光素Alexa标记小分子肽(前期工作已完成)，构建Alexa-cdGIGPQc-ScFvαvβ3。建立人裸鼠肺癌动物模型，于鼠尾静脉注射Alexa-cdGIGPQc-ScFvαvβ3，利用荧光扫描仪动态观察在荷瘤小鼠各脏器中的分布，分析其特异性。(3)、cdGIGPQc-ScFvαvβ3的生物相容性及毒性分析①选择SD大鼠和实验犬通过异常毒性或急性毒性试验观察分子探针体内静脉给药的安全性。②选择大鼠和实验犬通过长期毒性试验观察cdGIGPQc-ScFvαvβ3体内静脉给药的安全性。③观察记录的内容包括皮肤、粘膜、毛色、眼睛、呼吸、循环、自主及中枢神经系统行为表现等。④对所有实验动物的重要组织器官如心脏、肝脏、肺脏、肾脏等作常规病理组织学和电镜检查，观察分子探针对细胞有无毒性作用。⑤分析常规血液指标如红、白细胞计数及血红蛋白等改变；血液生化自动仪测定谷丙转氨酶、谷草转氨酶等常规生化指标。(4)、cdGIGPQc-ScFvαvβ3对体内抑瘤疗效通过比较cdGIGPQc-ScFvαvβ3与对照组(ScFvαvβ3、cNAQAEQc-ScFvαvβ3、空白组)对肺癌细胞和人裸鼠肺癌动物模型的瘤体治疗效果，评价cdGIGPQc-ScFvαvβ3对肺癌瘤体的抑瘤疗效。下面结合具体实验对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。一、cdGIGPQc-ScFv的构建与分析采用自动多肽合成仪常规固相法(SPPS)合成肺癌特异性小分子肽cdGIGPQc(简写为cd)和非相关小分子肽cNAQAEQc(简写为cN)，小分子肽由8个不同的氨基酸组成的短肽。其中，c表示D型半胱氨酸，d表示D型天冬氨酸，G表示L型甘氨酸，I代表L型异亮氨酸，P代表L型脯氨酸，Q代表L型谷氨酰胺，N代表L型天冬酰胺，A代表L型丙氨酸，E代表L型谷氨酸。小分子肽经固相合成法(SPPS)合成后，利用电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析其结构，并通过高效液相层析(HPLC)加以纯化。cdGIGPQc和cNAQAEQc的分子结构及纯度见图1和图2，cdGIGPQc(图1)和cNAQAEQc(图2)的HPLC报告中的峰值，提示其纯度分别为96.45％、95.08％。本专利技术利用整合素αvβ3的单链抗体(scFvαvβ3)替代单克隆抗体，所述单链抗体是把单克隆抗体重链的可变区(VH)和轻链的可变区(VL)基因在DNA水平克隆出来，再用一段连接肽(GGGGS)3的基因把VH和VL的羧基端和氨基端以VH-lin本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向肺癌的偶联药物，是小分子肽cdGIGPQc和整合素αvβ3的单链抗体ScFvαvβ3通过偶联得到，记名为cdGIGPQc‑ ScFvαvβ3。

【技术特征摘要】
1.一种靶向肺癌的偶联药物，是小分子肽cdGIGPQc和整合素αvβ3的单链抗体ScFvαvβ3通过偶联得到，记名为cdGIGPQc-ScFvαvβ3。2.根据权利要求1所述的偶联药物，其特征在于：小分子肽cdGIGPQc中，c表示D型半胱氨酸，d表示D型天冬氨酸，G表示L型甘氨酸，I代表L型异亮氨酸，P代表L型脯氨酸，Q代表L型谷氨酰胺。3.根据权利要求1所述的偶联药物，其特征在于：整合素αvβ3单链抗体ScFvαvβ3的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张帆，郭琳琅，裘倩倩，王琼瑶，
申请(专利权)人：南方医科大学珠江医院，
类型：发明
国别省市：广东;44