产生具有改变的N-和O-糖基化模式的糖蛋白的细胞及其方法和用途技术

本申请涉及糖工程领域，更具体地涉及其中存在内切氨基葡萄糖苷酶并且使UDP‑半乳糖4‑差向异构酶(GalE)缺陷的真核细胞。典型地，糖蛋白也存在于这些细胞中。这些细胞可用于使(外源性)糖蛋白去糖基化或部分去糖基化，尤其是不需要添加额外的酶。还提供了在蛋白质生产中应用这些细胞的方法。

Cells producing glycoproteins of altered N- and O- glycosylation modes and methods and uses thereof

This application relates to the field of sugar engineering, and more specifically to the eukaryotic cells in which there are endosaminidase glucosidase and UDP deficient galactose 4 differential isomerase (GalE) deficiency. Typically, glycoproteins also exist in these cells. These cells can be used to de glycosylation or partial glycosylation of exogenous glycoproteins, especially without additional enzymes. Methods for the application of these cells in protein production are also provided.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】产生具有改变的N-和O-糖基化模式的糖蛋白的细胞及其方法和用途
本申请涉及糖工程领域，更具体地涉及其中存在内切氨基葡萄糖苷酶并且使UDP-半乳糖4-差向异构酶(GalE)缺陷的真核细胞。典型地，糖蛋白也存在于这些细胞中。这些细胞可用于使(外源性)糖蛋白去糖基化或部分去糖基化，尤其是不需要添加额外的酶。还提供了在蛋白质生产中应用这些细胞的方法。
技术介绍
糖蛋白是一类重要的生物分子，其在细胞粘附、肿瘤转移、病原体感染和免疫应答等许多生物事件中发挥重要作用。大多数哺乳动物细胞表面蛋白和人血清蛋白是糖蛋白，并且因此治疗性糖蛋白是一类重要的生物技术产品就不足为奇了。除了许多其他之外，这些包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、白细胞介素-2，促红细胞生成素(EPO)和抗体等。典型地，天然糖蛋白和重组糖蛋白两者作为仅在悬垂的寡糖的结构上不同的糖形的混合物而产生。糖基化的这种异质性是糖蛋白的结构和功能研究(例如结晶研究)以及糖蛋白药物开发中的主要问题。例如，附接的糖链可能对蛋白质折叠、稳定性、作用、药代动力学和糖蛋白的血清半衰期具有深远的影响，并且一些糖链具有非常强的免疫原性。糖基化是真核细胞中蛋白质的最常见的翻译后修饰之一。N-糖基化是高度保守的代谢过程，其在真核细胞中对生存能力至关重要。蛋白质N-糖基化源自内质网(ER)，其中在长萜醇(脂质载体中间体)上装配的N-连接的寡糖(Glc3Man9GlcNAc2)被转移至新生蛋白质的适当的天冬酰胺残基(Asn)。这是对所有真核生物来说很常见的共翻译事件。三个葡萄糖残基和一个特定α-1,2-连接的甘露糖残基被ER中的特定葡萄糖苷酶和α-1,2-甘露糖苷酶去除，导致核心寡糖结构Man8GlcNAc2。具有这种核心糖结构的蛋白质被运输到高尔基体，在高尔基体中糖部分经历各种修饰。糖基转移酶和甘露糖苷酶排列在ER和高尔基体的内部(腔内)表面，并且从而提供催化表面，该催化表面允许糖蛋白在通过ER和高尔基网行进时进行顺序加工。顺面、中间和反面高尔基体以及反面高尔基网(TGN)的多个区室提供不同的位置，在这些位置中可以有序发生糖基化反应。由于糖蛋白从ER中合成行进到在后期高尔基体或TGN中完全成熟，该糖蛋白依次暴露于不同的糖苷酶、甘露糖苷酶和糖基转移酶，使得可以合成特定N-聚糖结构。低等和高等真核细胞之间，高尔基体中的糖链的修饰存在显著差异。在高等真核细胞中，N-连接的寡糖典型地是高甘露糖型、复合型和混合(杂合)型结构，这些结构与酵母中产生的那些结构显著不同(Kornfeld等人，Ann.Rev.Biochem.[生物化学综合年刊]54:631-664(1985))。在哺乳动物细胞中，糖链的修饰可以遵循3种不同途径，这取决于其添加的蛋白质部分。即：(1)核心糖链不变；(2)通过将UDP-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)中的N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸部分(GlcNAc-1-P)添加到核心糖链中的甘露糖的6-位置处，随后去除GlcNAc部分以在糖蛋白中形成酸性糖链来改变核心糖链；以及(3)首先通过用高尔基α-甘露糖苷酶I去除3个甘露糖残基来将核心糖链转化为Man5GlcNAc2；然后通过添加GlcNAc并且再去除2个甘露糖残基，随后依次添加GlcNAc、半乳糖(Gal)、GalNAc、岩藻糖和N-乙酰神经氨酸(也称为唾液酸(NeuNAc))来进一步修饰Man5GlcNAc2，以形成各种杂合或复合糖链(R.Kornfeld和S.Kornfeld，1985；Chiba等人，1998)。不同的生物体提供不同的糖基化酶(糖基转移酶和糖苷酶)和不同的糖基底物，使得糖侧链的最终组成可以根据高等真核细胞宿主而显著变化。典型地，动物糖蛋白的蛋白质N-聚糖具有二、三、或四触角结构。这些分支结构通过GlcNAc转移酶催化的将GlcNAc添加到寡糖残基的区域来合成。在它们形成之后，用不同的糖(包括Gal、GalNAc、GlcNAc、岩藻糖(Fuc)和唾液酸残基)终止触角结构。在酵母和丝状真菌(低等真核细胞)中，只有一部分Man8(9)GlcNAc2结构被(部分地)修剪成Man5GlcNAc2。然后可以通过在二酯键中添加甘露糖和/或甘露糖磷酸残基，将这些寡糖进一步修饰成真菌特异性聚糖。所得到的聚糖被称为“高甘露糖”型聚糖或甘露聚糖。例如，酵母糖肽包括由9-13个甘露糖残基的高甘露糖核心或由多达200个残基组成的延伸的支链甘露聚糖外链组成的寡糖结构(Ballou等人，Dev.Biol.[发育生物学]166:363-379(1992)；Trimble等人，Glycobiology[糖生物学]2:57-75(1992))。针对鉴定和优化用于治疗应用的糖肽和糖蛋白的制备的新策略已付出了相当大的努力。在许多有效方法中，大多数记录的方法可能是将产生具有所希望的糖基化模式的糖肽的细胞宿主工程化。针对关于如何实现这一点(具体是在酵母中)的最近的综述，参见Wildt等人，Naturereviews[自然评论]2005,119-28；和Hamilton等人，CurrOpinBiotechnol.[生物技术当前述评]2007；18(5):387-92。其他示例性方法包括化学合成、酶促合成、形成的糖肽的酶促重构以及当然还有作为一种或多种这些技术杂合或组合的方法。关于细胞宿主系统，原则上可以使用哺乳动物、昆虫、酵母、真菌、植物或原核细胞培养系统来以商业上可行的量生产大多数治疗性和其他糖肽。然而，实际上，难以实现在重组产生的蛋白质上的所希望的糖基化模式。例如，细菌不经由长萜醇途径进行N-糖基化，并且酵母仅产生寡甘露糖型N-聚糖，这种聚糖在人类中通常不大量存在并会被肝脏驻留的巨噬细胞积极清除。类似地，植物细胞不产生唾液酸化的寡糖(人糖肽的普通组分)。此外，植物添加木糖和/或α-1,3-连接的岩藻糖到蛋白质N-聚糖中，导致与动物结构不同并且在哺乳动物中具有免疫原性的糖蛋白(Lerouge等人，PlantMolBiol.[植物分子生物学]1998；38(1-2):31-48；Betenbaugh等人，CurrOpinStructBiol.[结构生物学当前述评]2004；14(5):601-6；Altmann,IntArchAllergyImmunol.[变态反应与免疫学国际档案]2007；142(2):99-115)：如最近综述的，目前可用于生产重组哺乳动物糖肽的昆虫细胞系统都不会生产具有在哺乳动物中生产时通常发现的相同聚糖的糖肽(Harrison和Jarvis，2006,159)。此外，当在不同的细胞培养条件下产生时(Watson等人，Biotechnol.Prog.[生物技术的进展]10:39-44(1994)；和Gawlitzek等人，Biotechnol.J.[生物技术杂志]42:117-131(1995))或者甚至在名义上相同的细胞培养条件下在两种不同的生物反应器中产生的糖肽之间(Kunkel等人，Biotechnol.Prog.[生物技术的进展]2000:462-470(2000))，重组糖肽的糖基化模式也可以不同。因此，尽管在这个领域取得了重大进展，糖基化的异质性仍然是一个问题。由本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种真核细胞，该真核细胞包含编码内切氨基葡萄糖苷酶的外源性核酸序列并且在内源性UDP‑半乳糖4‑差向异构酶(GalE)的表达和/或活性方面有缺陷。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.07.09 EP 15176111.11.一种真核细胞，该真核细胞包含编码内切氨基葡萄糖苷酶的外源性核酸序列并且在内源性UDP-半乳糖4-差向异构酶(GalE)的表达和/或活性方面有缺陷。2.根据权利要求1所述的真核细胞，该真核细胞进一步包含编码糖蛋白的第二外源性核酸序列。3.根据权利要求1或2所述的真核细胞，该真核细胞不表达内源性内切氨基葡萄糖苷酶。4.根据权利要求1至3中任一项所述的真核细胞，该真核细胞是哺乳动物细胞，具体是Hek293细胞或CHO细胞。5.根据权利要求1至4中任一项所述的真核细胞，其中该内切氨基葡萄糖苷酶是甘露糖基-糖蛋白内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(E.C.3.2.1.96)，具体是EndoT。6.根据权利要求1至5中任一项所述的真核细胞，其中该糖蛋白由该细胞分泌。7.根据权利要求1至6中任一项所述的真核细胞，其中该内切氨基葡萄糖苷酶有效地连接至ER或高尔基体定位信号。8.一种用于在真核细胞中产生缺乏O-糖基化的单一GlcNAc修饰的蛋白质的方法，该方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：N·卡勒维尔特，L·缪里斯，F·桑滕，
申请(专利权)人：非营利性组织佛兰芒综合大学生物技术研究所，国立比利时根特大学，
类型：发明
国别省市：比利时,BE