本发明专利技术公开了一种获得具有快速生长能力的分枝杆菌菌种的方法，其特征在于利用原生质体融合的方法将两种分枝杆菌进行融合，筛选出具有两个菌种特性的菌种，该菌种既能够将植物甾醇高效率转化成雄烯二酮，又能够有较快的生长速度。该菌株能够有效地提高生长速度，缩短发酵时间，减少动力消耗，降低生产成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于菌种选育技 术领域。
技术介绍
雄烯二酮是从精巢或尿中提取出的具有雄性激素作用的一种留类化合物，单 纯的依靠化学方法生产雄烯二酮远远达不到市场的需求。通过微生物选择性降解甾醇 侧链，可得到制备留体激素类药物的重要中间体雄烯二酮（雄留-4-烯-3, 17-二酮， androst-4-ene-3，17-dione，简称AD)。因此采用微生物发酵生产生产AD具有产品纯度 高、生产成本低、周期短等特点，是当前的一大趋势。 但目前市场上雄烯二酮仍处于供不应求的状态，主要原因是雄烯二酮生产厂家 少，市场需求大。本企业以生产雄烯二酮为主，生产上存在的困难是：菌株转化能力较强，但 种子生产周期较长，易染菌，增加动力消耗，增加生产成本，严重影响生产效益。
技术实现思路
本专利技术利用原生质体融合技术，将具有不同特性的菌种进行融合，能够得到具有 两种生长特性的新菌株，从而缩短种子生长周期，减少动力消耗，降低生产成本；同时拓宽 了微生物的遗传种质资源，丰富了基因库的内容，促进了微生物菌种选育技术的进步。 -.高转化能力分枝杆菌菌株I的获得，其步骤是： 通过分离、初筛和复筛选，取一株能够将植物留醇高效转化的分枝杆菌菌株作为初始 菌株I。 所用斜面平板筛选培养基为（g/L):葡萄糖20,黄豆饼粉5,柠檬酸3,磷酸二氢 钾，0.5,尿素0.5,七水硫酸0. 1，硫酸亚铁0.01，碳酸钙2,琼脂20 ;种子瓶培养基为（g/ L):葡萄糖30,黄豆饼粉10,柠檬酸3,硫酸铵，15,磷酸二氢钾0.5,七水硫酸0. 1，硫酸亚铁 0.01，碳酸钙2,玉米浆5,泡敌0.2，pH值8.0。;发酵瓶培养基为（g/L):硝酸钠6,磷酸氢二 铵0.5,玉米浆15,豆油160,甾醇35.pH值8.0。 二.具有快速生长能力的分枝杆菌菌株II的获得，其步骤是： 通过分离、初筛和复筛选，取一株能够将植物留醇高效转化的分枝杆菌菌株作为初始 菌株II 所用斜面平板筛选培养基为：BD琼脂培养基（REF213000)，种子瓶培养基为：葡萄糖5， 硝酸钠6,磷酸氢二铵0.5,丙三醇1.5,泡敌0. 1 ;pH值8.0 ;发酵培养基为：硝酸钠6,磷酸 氢二铵0.5,玉米浆15,豆油160,甾醇35.pH值8.0。 三.菌株I和II的原生质体融合，其步骤是： (1)孢子悬液的制备：将菌株I和II分别制备成孢子悬液。 (2 )菌体的培养：取适量孢子悬液接入种子瓶内，在适宜条件下将菌体培养至对数 生长期。 (3)原生质体的融合：将菌株I和II进行原生质体融合，包括原生质体的分离、再 生以及原生质体的融合。 (4)筛选合适菌株：随机挑选若干融合后长出的菌株，制备母斜面，培养成熟后接 摇瓶进行发酵培养，测定其效价。 (5)遗传稳定性考察：对筛选得到的合适菌株进行多次传代试验，考察其遗传性状 的稳定性，最终筛选得到转化能力强且生长速度快的菌株。 (6)发酵罐试验：将所筛选的合适菌株进行发酵罐试验，测定其效价。 以上所述的原生质体融合过程中溶酶菌浓度为2. 5mg/ml，34°C，酶解lh;热灭活 温度为60°C，时间为lOmin。 筛选配方、摇瓶培养和发酵配方同一。 本专利技术的优点及效果 1.本专利技术中利用原生质体融合技术对菌株进行筛选，不存在远源杂交不融合的缺点， 所筛选出的菌种稳定性好，是一种比较理想的微生物菌种定向选育方法。 2.利用原生质体融合技术时遗传物质得到充分重组，获得转化能力强且生长速度 快的重组子。有效地提高菌株生长速度，缩短了发酵时间，减少了动力消耗，降低了生产成 本。【具体实施方式】 下面通过实施例对本专利技术做进一步说明，下述实例是说明性的，不是限定性的，不 能以下述实例来限定本专利技术的保护范围。 一.选取一株高转化能力的分枝杆菌菌株I 1.分离 从保存的原始菌株甘油管中吸取lml菌悬液，梯度稀释涂布到原始配方的的平板上， 30 土 1°C，湿度 30%-60% 培养 7 天。 2.制备斜面菌种 挑选菌落直径为4mm以上，形态边缘不规则，橙黄色的单菌落均匀涂布到斜面培养基 上，30 土 1°C，湿度30%-60%培养7天。 3.摇瓶考察 将成熟斜面接种到种子瓶中，30土 1°C，湿度30%-60%培养70h，菌体量大，pH值达到8. 0 以上转接到发酵瓶中，发酵瓶30土 1°C，湿度30%-60%培养7天，放瓶测效价，选取转化能力 最高的DY327作为出发菌株，能够将3. 5%留醇转化完全，AD生成量为1. 83g。 二.选取一株生长速度快的分枝杆菌菌株II， 1.分离 从保存的原始菌株甘油管中吸取lml菌悬液，梯度稀释涂布到原始配方的的平板上， 30 土 1°C，湿度 30%-60% 培养 7 天。 2.制备斜面菌种 挑选菌落直径为4mm以上，形态边缘不规则，橙黄色的单菌落均匀涂布到斜面培养基 上，30 土 1°C，湿度30%-60%培养7天。 3.摇瓶考察 将成熟斜面接种到种子瓶中，30 土rC，湿度30%-60%培养40h，选取在40h时菌体量大 且pH值达到8. 0以上的菌株DY381作为出发菌株。 三.菌株的原生质体融合 1. 菌悬液的制备 取菌株I(DY327)和II(DY381)成熟斜面各一支，将菌体刮下，放入装有无菌水和玻璃 珠的三角瓶中，打散均匀后，血球计数板计数，将菌体浓度调整为10s个/ml，作为待处理菌 液， 2. 菌体培养 在500ml的三角瓶内装100ml种子培养基，接种菌悬液1. 0ml，30°C，200rpm振荡培养 到对数生长期。为使生长的菌体容易被溶菌酶酶解成原生质体，需加入等体积0. 5%的甘氨 酸高渗预处理lh。 3原生质体的融合 A.原生质体的分离 3000r/min离心当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
选取一株高转化率分枝杆菌菌株Ⅰ，其步骤是：通过分离、初筛和复筛选取一株能够将植物甾醇高效转化的分枝杆菌菌株作为初始菌株。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李瑾，于新令，余洪智，
申请(专利权)人：山东方明药业集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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