一种高效去除大型海藻表面附生微生物的方法技术

本发明专利技术属于海藻生物技术领域，涉及一种高效去除大型海藻表面附生微生物的方法。具体通过石英砂与待处理大型海藻共震，去除待处理大型海藻表面附生微生物。采用本发明专利技术能高效、彻底清除大型海藻表面附生微生物，同时对内生微生物不具干扰。可用于海藻内共生微生物的分离纯化及其活性天然产物研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于海藻生物
，涉及。
技术介绍
大型海藻属于低等植物，主要包括褐藻、红藻和绿藻。其中许多经济种类是人工栽培的对象，例如褐藻类的海带(Saccharina spp.)、裙带菜(Undaria pinnatifida)、羊栖菜(Sargassum fusiforme)，红藻类的紫菜(Pyropia spp.)、红毛菜(Bangia spp.)、江蓠(Gracilaria spp.)、石花菜(Gelidium spp.)、麒麟菜(Eucheuma spp.)，以及绿藻类的消1笞与石药(Ulva spp.) ο大型海藻不仅可做为健康食品(如紫菜、红毛菜、海带、裙带菜、浒苔)，还可用于提取制备碘、甘露醇、藻胶等重要化工原料。另外，近年研究发现，大型海藻还是细菌、放线菌、真菌等海洋微生物的重要宿主，其共附生微生物可以产生丰富的结构新颖、活性独特的次级代谢产物，是药物先导化合物的重要资源宝库。近年来，从藻栖真菌中得到的化合物和新颖化合物分别占到海洋真菌全部化合物及新颖化合物总数的24% -27%，从藻栖细菌中也得到了如细菌素、生物酶、大环内酯等具有特殊活性的次级代谢产物。利用分离纯化的海藻共附生微生物进行规模发酵与提取纯化，已经成为获得新化合物的重要手段。海藻共附生微生物既包括存在于藻细胞表面的附生微生物，也包括存在于藻细胞内部的内共生微生物。高等植物共附生微生物及其次生代谢产物的研究发现，与附生微生物相比，内共生微生物与宿主之间存在着更加高度依赖的互利关系。宿主给内共生微生物提供营养，内共生微生物则分泌植物激素刺激宿主生长，还可产生一些抗生性的次生代谢产物帮助宿主抵抗外界病菌及虫害，其中，部分次级代谢产物已证实具有突出的药用价值，例如，原产于红豆杉等少数珍稀植物的高效抗肿瘤药物紫杉醇，现已证实来自红豆杉的内生真菌。同样，藻类相关研究中也发现，与藻体体表的附生微生物相比，内共生微生物不易受到外界环境干扰，与藻类宿主的特异性更加明显，相互作用更加密切，从中获得独特和新颖化合物的潜力也具显著优势，因此，海藻内共生微生物的分离纯化得到了普遍关注。为了获得大型海藻内共生微生物的纯培养，必须建立一种高效清除体表附生微生物的方法。现有的方法主要包括酶法、化学法和物理法等几种解决方法。由于海藻附生微生物并非仅仅简单地附着于细胞表面，而是通过多糖、蛋白、核酸等大分子网状结构与宿主细胞建立相对紧密的联系，因此，常规的温和方法难以做到有效清除，会残留大量的附生微生物。例如，玻璃珠与藻类共震荡、超声波处理等物理方法对内生微生物影响较小，但是已经有研究表明无法将附生微生物去除干净。相反，由于海藻藻体往往比较脆弱，使用剧烈的方法又会导致细胞的破裂、或者内生微生物的杀伤。例如，化学方法中的漂白粉处理能够将附生微生物去除干净，但是会对内共生微生物产生严重影响，甚至完全杀灭。而酶法普遍需要经过高温的酶促处理，同样会对内共生微生物的多样性组成产生显著影响。因此，为了满足大型海藻内共生微生物次级代谢产物研究与制备的要求，必须要开发一种既能将附生微生物高效彻底清除，同时对内生微生物不具干扰的新方法，兼顾两方面的平衡。
技术实现思路
针对上述突出问题，本专利技术的目的是提供一种高效、彻底去除大型海藻表面附生微生物的方法。为实现上述目的，本专利技术技术方案如下:—种高效去除大型海藻表面附生微生物的方法，通过石英砂与待处理大型海藻共震，去除待处理大型海藻表面附生微生物。进一步的说，研磨筛选125-250 μπι粒径的石英砂，而后将过量的石英砂与海藻藻体混合(石英砂与海藻藻体按照质量比为10:1—20:1)，混合后在3200rpm条件下震荡2 X 15min，利用震荡彻底清除海藻表面附生微生物，并保存完好的细胞。上述震荡结束后，将藻体与石英砂分离，无菌海水冲洗后研磨藻体并用适合培养基培养，即可获得藻类内共生微生物纯培养。进一步的是，清除附生微生物后的海藻材料用于内共生微生物的分离；或用于无附生微生物海藻材料的获得与培养；震荡后的清洗液经收集过滤用于附生微生物的组成分析或分离纯化。所述石英砂为普通商品化石英砂。所述大型海藻为海洋绿藻、红藻或褐藻。所述附生与内共生微生物为细菌、放线菌、真菌。与现有方法相比，本专利技术提出了一种新思路，具有如下有益效果:1.本专利技术技术不依赖任何商品化的酶制剂或生化试剂。仅以普通石英砂为原料，通过研磨并经筛选获得特定粒径的石英砂，成本低廉，易于大批量制备。2.本专利技术对海藻表面附生微生物的清除非常高效，一般只需通过藻体与石英砂共震荡处理30分钟就可以彻底清除藻类附生微生物，既要将外生菌彻底去除，又要保持细胞完好，同时，对藻类内共生微生物几无影响，兼顾了两方面的要求。而现有方法不仅高度依赖商品化的酶和化学试剂，而且效果不理想，温和方法不能完全清除附生微生物，而剧烈方法又对内生微生物造成了严重杀伤，不能满足要求。3.本专利技术适用的海藻材料非常广泛，不仅适用于新鲜的海藻材料(图1，ο4)，也适用于冻存海藻材料(图2，05)。4.本专利技术可满足多种研究需求，清除附生微生物后的海藻材料不仅可用于内共生微生物的分离，也可用于无附生微生物海藻材料的获得与培养，另外，震荡后的清洗液还可经收集过滤用于附生微生物的组成分析或分离纯化。【附图说明】图1为扫描电镜表征各种处理方法对海藻附生微生物的去除效果(a:鲜浒苔，未处理；b:冷冻浒苔，未处理；c:溶菌酶处理组；d:木瓜蛋白酶处理组；e:蜗牛酶处理组；f:纤维素酶处理组；g:溶菌酶+木瓜蛋白酶+蜗牛酶处理组；h:多酶清洗剂处理组；1:蛋白酶K处理组；j:酒精处理组；k:漂白粉处理组；1:UNSET buffer处理组:超声波处理组；η:玻璃珠涡旋振荡处理组；ol:60-120 μπι石英砂震荡2Xlh ；o2:125-250 μm石英砂振荡2X lh ；o3:125-250 μ m 石英砂振荡 2X 30min ；o4:125-250 μ m 石英砂振荡 2X 15min ；o5:o4条件应用于冻存浒苔；p:o4条件应用于冻存浒苔其它株系；q:o4条件应用于鲜浒苔其它株系；r:o4条件应用于扁浒苔；s:o4条件应用于缘管浒苔；t:玻璃珠与125-250 μπι石英砂。自a至s，标尺为10 μm ;t中标尺为1mm)。图2为DGGE方法分析各处理组细菌群落结构(m、a、k、1、1、o4:同图1 ;u:o4组震荡后的清洗液经滤膜过滤后提取DNA，代表附生菌。黑色箭头示内共生与附生菌存在差异的条带)。【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术的方法及该方法所达到的效果作进一步详细说明。本专利技术利用研磨和筛选得到特定粒径范围的石英砂，通过石英砂与海藻共震荡来彻底去除海藻表面附生微生物。采用本专利技术能高效、彻底清除大型海藻表面当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效去除大型海藻表面附生微生物的方法，其特征在于：通过石英砂与待处理大型海藻共震，去除待处理大型海藻表面附生微生物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：姜鹏，刘晓杰，赵瑾，陈华新，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37