本发明专利技术公开了一种运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测肠出血性大肠埃希菌的试剂及其扩增方法和检测方法，设计了五个引物组序列，５’ＣＡＧＴＣＧＴＡＣＧＧＧＧＡＴＧＣＡＧ；５’ＴＣＡＧＣＡＧＴＣＡＴＴＡＣＡＴＡＡＧ；５’ＧＣＴＣＴＴＧＣＣＡＣＡＧＡＣＴＧＣＧＴＣ；５＇ ＡＧＧＴＴＣＣＧＣＴＡＴＧＣＧＡＣＡＴ；５＇ＧＣＴＣＴＴＧＣＣＡＣＡＧＡＣＴＧＣＧＴＣＡＧＴＴＴＣＧＣＣＡＴＴＣＧＴＴＧＡＣＴＡＣＴＴ。针对肠出血性大肠埃希菌Ｏ１５７：Ｈ７菌，本发明专利技术克服了现有技术中的缺点，提供一种运用交叉引物核酸恒温扩增技术快速低成本的检测方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细菌检验技术，具体地说是运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测肠出血性大肠埃希菌0157 :H7的的试剂及其扩增方法和检测方法。
技术介绍
肠出血性大肠埃希菌0157 :H7属于肠杆菌科埃希菌属，是肠出血性大肠埃希菌的主要血清型，能引起的出血性结肠炎。1982年在美国俄勒岗州和密执安州，因食用汉堡包引起的食物中毒的病人粪便中被分离并命名的。据美国疾病控制中心(CDC)报告，每年全国约发现2万多例病人。死亡人数200-500人，以后陆续在全球五大州20多个国家被发现或引起暴发和流行。自82年发现至今，发生规模最大的一次爆发是97年5月下旬，日本冈山、广岛等县几十所中学和幼儿园相继发生6起集体食物中毒事件，人数多达1600人，导致3名儿童死亡，住院儿童达80人。同时日本仙台和鹿儿岛形成中毒人数过万人，死亡11 人，波及44个都府县的爆发性食物中毒，引起全世界的关注。此外美国、加拿大、瑞典、澳大利亚、苏格兰、威尔士等国家和地区也相继报道了散发性感染和暴发流行。我国1988年首次分离到肠出血性大肠埃希菌0157:H7。从已有的流行病学调查资料看，我国也存在散发病例，还没有爆发流行的报道。近几年也通过监测，先后从牛、猪、羊、粪便，肉类等食品中查到肠出血性大肠埃希菌0157:H7。快速、准确的检测肠出血性大肠埃希菌0157:H7是有效预防和控制肠杆菌感染的前提条件。随着分子生物学的发展，实际工作中的细菌鉴定方法已经从传统的简单生化实验水平上向分子生物学的方法如PCR、探针杂交等技术发展。近期开发出来的交叉引物核酸恒温扩增技术是一种更为高效的分子检测方法，已经被很多国家认同，并大力发展。
技术实现思路
针对肠出血性大肠埃希菌0157:H7，本专利技术克服了现有技术中的缺点，提供一种快速、便捷、低成本的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测肠出血性大肠埃希菌0157 :H7的的试剂及其扩增方法和检测方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是一种运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测肠出血性大肠埃希菌的试剂，包括以下五个引物SEQ ID NO. 1 :5’ CAGTCGTACGGGGATGCAG SEQ ID NO. 2:5’ TCAGCAGTCATTACATAAG SEQ ID NO. 3:5’ GCTCTTGCCACAGACTGCGTC SEQ ID NO. 4 5' AGGTTCCGCTATGCGACATSEQ ID NO. 5 5' GCTCTTGCCACAGACTGCGTCAGTTTCGCCATTCGTTGACTACTT 其中引物序列3的5’端有异硫氰酸荧光素基团标记，引物序列4的5’端有生物素荧光基团标记。核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下成分浓度加样量Bst Sl5U/u L1 u LBst酶缓冲液-5 ii LSEQ ID NO. 1 10umol/L1 u LSEQ ID NO. 2 lOumol/L1 u LSEQ ID NO. 3 lOumol/L0. 5 u LSEQ ID NO. 4 lOumol/L0. 5 u LSEQ ID NO. 5 lOumol/L0. 2 u LDNA 样品2iiL双蒸水13. 8iiL总体积25 ii L其中 Bst 酶缓冲液的成分为 20 mM Tris-HCl、10 mM (NH4)2SO4UO mM KCl,2 mM MgSO4、质量百分比 0. 1 % Triton X-100，且 pH 为 8. 8。所述的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测肠出血性大肠埃希菌的试剂的扩增 方法，核酸扩增程序为(1)63°C 90 分钟；(2)80°C2 分钟。所述的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测肠出血性大肠埃希菌的试剂的检测 方法，将反应液滴至能够检测异硫氰酸荧光素基团和生物素荧光基团同时标记的核酸样品 的胶体金检测试紙上，在15-30分钟内读取結果，如果仅在质控区C出现一条红线，表示样 品中无肠出血性大肠埃希菌0157:H7 ；如果出现两条红线，一条检测线，一条质控线，表示 样品中存在肠出血性大肠埃希菌0157:H7 ；如果无红线出现。表明检测失败，样品需要重新 检测。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是相比传统生理生化检测方法，交叉引物核 酸恒温扩增技术适用于直接从患者含菌体液、粪便，食品和体液培养物等临床样品中扩增 靶基因，只需要一次恒温扩增就能够检测肠出血性大肠埃希菌0157:H7是否存在，大大提 高了效率节约了时间。相比较其它方法，本方法制仅需要简单的设备即可，大大提高了性价 比节约了成本。该技术检测肠出血性大肠埃希菌0157:H7具有检测准确、特异性强、灵敏度 高的特点，可以快速、准确地鉴定，避免了反复培养，节约时间；该方法不受培养条件和細菌 生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确。附图说明图1是本专利技术结果判读示意图。图2是本专利技术运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测肠出血性大肠埃希菌0157:H7 的实验结果(检测条1.肠炎肠出血性大肠埃希菌0157:H7 CIQ103检测結果；检测条2.肠 炎肠出血性大肠埃希菌0157:H7 CIQ109检测结果；检测条3.肠炎肠出血性大肠埃希菌 0157:H7 CIQ79检测結果；检测条4.志贺氏菌ATCC12022检测結果；检测条5.空白对照)。具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明 本专利技术是通过以下技术方案实现的(1)设计特异性寡核苷酸引物用于交叉引物核酸恒温扩增技术检测；(2)整合各引物使之不相互干扰。(3)以引物序列组，扩增待测样品模板，进行目的基因的特异性扩增； (4)扩增完毕后可通过特定的胶体金检测试纸条目测结果。该方法包括应用该方法检测肠出血性大肠埃希菌0157:H7所使用的引物组和与之配套的核酸扩增反应条件。其中引物序列如下SEQ ID NO. 1 :5’ CAGTCGTACGGGGATGCAG ‘TCAGCAGTCATTACATAAG ‘GCTCTTGCCACAGACTGCGTC AGGTTCCGCTATGCGACATGCTCTTGCCACAGACTGCGTCAGTTTCGCCATTCGTTGACTACTT 其中引物序列3的5’端有异硫氰酸荧光素基团标记。引物序列4的5’端有生物素荧光基团标记。该引物为和肠出血性大肠埃希菌致病性密切相关的志贺样肠毒素A亚基基因中(shiga-like toxin 1 subunit Α)挑选设计的，参考序列为 GenBank AE005174. 2 Escherichia coli partial stxl gene for shiga toxin 1, strain EHEC FE94076,检测基因区域为2996033 2996980。优选的本专利技术中荧光PCR反应体系中各组分构成比例如下SEQIDNO. 2 5'SEQIDN0. 3 5'SEQIDN0. 4 5'SEQIDN0. 5 5'成分浓度加样量Bst酶5υ/μ L1 μ LBst酶缓冲液-5 μ LSEQIDN0.110 μ mol/,L1 μ LSEQIDNO.210 μ mol/,L1 μ LSEQIDNO.310 μ mol/,L0. 5μ LSEQIDNO.410 μ本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测肠出血性大肠埃希菌的试剂，其特征在于，包括以下五个引物 ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１：５’ ＣＡＧＴＣＧＴＡＣＧＧＧＧＡＴＧＣＡＧＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２：５’ ＴＣＡＧＣＡＧＴＣＡＴＴＡＣＡＴＡＡＧＳＥＱＩＤ ＮＯ．３：５’ ＧＣＴＣＴＴＧＣＣＡＣＡＧＡＣＴＧＣＧＴＣＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４：５＇ ＡＧＧＴＴＣＣＧＣＴＡＴＧＣＧＡＣＡＴＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５：５＇ ＧＣＴＣＴＴＧＣＣＡＣＡＧＡＣＴＧＣＧＴＣＡＧＴＴＴＣＧＣＣＡＴＴＣＧＴＴＧＡＣＴＡＣＴＴ其中引物序列３的５’端有异硫氰酸荧光素基团标记，引物序列４的５’端有生物素荧光基团标记。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：祁军，
申请(专利权)人：杭州优思达生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：86
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