本发明专利技术公开了一种运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂及其扩增方法和检测方法，设计了五个引物组序列包括以下五个引物：５’ＧＣＧＧＡＡＧＴＣＧＣＧＧＣＣＣＧ；５’ＴＣＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡＧＧＡＡＣＣ；５’ＡＧＧＣＣＧＧＴＡＴＴＡＴＴＧＡＴＧＣ；ＴＴＴＣＴＣＴＧＧＡＴＧＧＴＡＴＧＣ；５’ＡＧＡＴＧＡＧＴＡＴＴＧＡＴＧＣＣＧＡＴＴＴＧＴＣＡＧＴＡＣＧＣＴＴＣＧＣＣＧＴＴＣＧＣ，其中引物序列３的５’端有异硫氰酸荧光素基团标记，引物序列４的５’端有生物素荧光基团标记。针对沙门菌，本发明专利技术克服了现有技术中的缺点，提供一种运用交叉引物核酸恒温扩增技术快速低成本的沙门菌检测方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细菌检验技术，具体地说是。
技术介绍
沙门菌属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌。已发现的近一千种(或菌株)。按其抗原成分，可分为甲、乙、丙、丁、戊等基本菌组。除引起人类的疾病外，大多数仅能目引起家畜、鼠类和禽类等动物的疾病，但有时也可污染人类的食物而引起食物中毒，可引起极为严重的食品中毒事件，并可以导致多种疾病发生，严重威胁着人们的健康。快速、准确的检测沙门菌是有效预防和控制肠杆菌感染的前提条件。随着分子生物学的发展，实际工作中的细菌鉴定方法已经从传统的简单生化实验水平上向分子生物学的方法如PCR、探针杂交等技术发展。近期开发出来的交叉引物核酸恒温扩增技术是一种更为高效的分子检测方法， 已经被很多国家认同，并大力发展。
技术实现思路
针对沙门菌，本专利技术克服了现有技术中的缺点，提供一种快速、便捷、低成本的。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是一种运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂，包括以下五个引物SEQ ID NO. 1 :5’ GCGGAAGTCGCGGCCCG SEQ ID NO. 2:5’ TCGCACCGTCAAAGGAACC SEQ ID NO. 3:5’ AGGCCGGTATTATTGATGC SEQ ID NO. 4 5' TTTCTCTGGATGGTATGCSEQ ID NO. 5 5' AGATGAGTATTGATGCCGATTTGTCAGTACGCTTCGCCGTTCGC 其中引物序列3的5’端有异硫氰酸荧光素基团标记，引物序列4的5’端有生物素荧光基团标记。核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下成分浓度加样量Bst酶5υ/μ L1 μ LBst酶缓冲液-5 μ LSEQIDN0.110 μ mol/,L1 μ LSEQIDNO.210 μ mol/,L1 μ LSEQIDNO.310 μ mol/,L0. 5μ LSEQIDNO.410 μ mol/,L0. 5μ LSEQIDNO.510 μ mol/0. 2μ LDNA 样品2iiL双蒸水13. 8iiL总体积25 ii L其中 Bst 酶缓冲液的成分为 20 mM Tris-HCl、10 mM (NH4)2SO4UO mM KC1、2 mM MgSO4、质量百分比 0. 1 % Triton X-100，且 pH 为 8. 8。核酸扩增程序为(1)63°C 90 分钟；(2)80°C2 分钟。所述的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂的检测方法，将反应液 滴至能够检测异硫氰酸荧光素基团和生物素荧光基团同时标记的核酸样品的胶体金检测 试纸上，在15-30分钟内读取結果，如果仅在质控区C出现一条红线，表示样品中无沙门氏 菌；如果出现两条红线，一条检测线，一条质控线，表示样品中存在沙门氏菌；如果无红线 出现，表明检测失败，样品需要重新检测。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是相比传统生理生化检测方法，交叉引物 核酸恒温扩增技术适用于直接从患者含菌体液、食品和体液培养物等临床样品中扩增靶基 因，只需要一次恒温扩增就能够检测沙门菌是否存在，大大提高了效率节约了时间。相比较 其它方法，本方法制仅需要简单的设备即可，大大提高了性价比节约了成本。该技术检测沙 门菌具有检测准确、特异性强、灵敏度高的特点，可以快速、准确地鉴定，避免了反复培养， 节约时间；该方法不受培养条件和細菌生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确。附图说明图1本专利技术结果判读示意图。图2本专利技术运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的实验结果(检测条1.肠 炎沙门菌Npl0012检测结果；检测条2.肠炎沙门菌CIQ021207检测结果；检测条3.肠炎 沙门菌CIQ070123检测结果；检测条4.志贺氏菌ATCC12022检测结果；检测条5.空白对 照)。具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进ー步详细说明 本专利技术是通过以下技术方案实现的(1)设计特异性寡核苷酸引物用于交叉引物核酸恒温扩增技术检测；(2)整合各引物使之不相互干扰。(3)以引物序列组，扩增待测样品模板，进行目的基因的特异性扩增； (4)扩增完毕后可通过特定的胶体金检测试纸条目测結果。本专利技术运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂，包括以下五个引物 SEQ ID N0. 1 :5’ GCGGAAGTCGCGGCCCGSEQ ID N0. 2:5’ TCGCACCGTCAAAGGAACC SEQ ID N0. 3:5’ AGGCCGGTATTATTGATGC SEQ ID N0. 4 5' TTTCTCTGGATGGTATGCSEQ ID NO. 5 5' AGATGAGTATTGATGCCGATTTGTCAGTACGCTTCGCCGTTCGC 其中引物序列3的5’端有异硫氰酸荧光素基团标记，引物序列4的5’端有生物素荧光基团标记。该引物为和沙门菌致病性密切相关的侵袭性蛋白A的基因中(invasion protein Α)挑选设计的，参考序列为 GenBank CP002487. 1 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. ST4/74, complete genome,检测基因区域为 3060976 3063033。优选的核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下成分浓度加样量Bst酶5υ/μ L1 μ LBst酶缓冲液-5 μ LSEQ ID NO. 110 μ mol/,L1 μ LSEQ ID NO. 210 μ mol/,L1 μ LSEQ ID NO. 310 μ mol/,L0. 5μ LSEQ ID NO. 410 μ mol/,L0. 5μ LSEQ ID NO. 510 μ mol/,L0. 2μ LDNA样品2μ L双蒸水13. 8 μ总体积25 μ其中 Bst 酶缓冲液的成分为 20 mM Tris-HCl、10 mM (NH4)2SO4UO mM KCl,2 mM MgSO4、质量百分比 0. 1 % Triton X-100，且 pH 为 8. 8。上述的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂的扩增方法，核酸扩增程序为(1)63°C90 分钟；(2)80°C2 分钟。如图1、2所示，上述的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂的检测方法，将反应液滴至能够检测异硫氰酸荧光素基团和生物素荧光基团同时标记的核酸样品的胶体金检测试纸上，在15-30分钟内读取结果，如果仅在质控区C出现一条红线，表示样品中无沙门氏菌；如果出现两条红线，一条检测线，一条质控线，表示样品中存在沙门氏菌； 如果无红线出现，表明检测失败，样品需要重新检测。实施例1 样本某肉馅。用常规生理、生化方法检测出沙门菌疑似菌落，然后进行如下交叉引物核酸恒温扩增检测(1)取100克待检样品，粉碎。(2)取1克样品进行核酸抽提。(3)交叉引物核酸恒温扩增反应体系中各组分构成比例如下成分浓度加样量Bst酶5υ/μ L1 μ LBst酶缓冲液-5 μ L引物序列一10 μ mol/,L1 μ L引物序列二10 μ mol/,L1 μ L引物序列三10 μ mol/,L0. 5μ L引物序列四10 μ本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂，其特征在于，包括以下五个引物 ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１：５’ ＧＣＧＧＡＡＧＴＣＧＣＧＧＣＣＣＧＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２：５’ ＴＣＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡＧＧＡＡＣＣＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３：５’ ＡＧＧＣＣＧＧＴＡＴＴＡＴＴＧＡＴＧＣＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４：５＇ ＴＴＴＣＴＣＴＧＧＡＴＧＧＴＡＴＧＣＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５：５＇ ＡＧＡＴＧＡＧＴＡＴＴＧＡＴＧＣＣＧＡＴＴＴＧＴＣＡＧＴＡＣＧＣＴＴＣＧＣＣＧＴＴＣＧＣ其中引物序列３的５’端有异硫氰酸荧光素基团标记，引物序列４的５’端有生物素荧光基团标记。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：祁军，
申请(专利权)人：杭州优思达生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：86
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