本发明专利技术公开了一种预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方法，主要包括以下步骤：根据绵羊ＫＡＰ１．１基因序列设计一对引物；从绵羊血液中提取基因组ＤＮＡ，利用该引物对绵羊的基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增；使用聚丙烯酰胺凝胶对ＰＣＲ产物进行电泳分离，检测出ＫＡＰ１．１基因外显子中的６０ｂｐ和３０ｂｐ插入／缺失的变异位点；多态性分析。本发明专利技术操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测。利用本发明专利技术不仅为绵羊育种工作中标记辅助选择提供了一个更为有效、简便易行的分子标记方法，同时为绵羊的细度性状改良提供了一种有效的分子标记育种手段，可以加速优质细毛羊的育种进程。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物分子遗传学领域，特别是涉及一种用分子标记检测绵羊毛纤维直径的方法。
技术介绍
我国是一个农业大国，畜牧业是我国农业的重要组成部分，畜牧业在国民经济中占有举足轻重的地位。据统计，2010年畜牧业收入的增长速度已超过种植业，成为农民收入的主要来源之一。大力发展畜牧业仍然是我国农业产业结构调整、农业和农村经济发展以及农民增收的重点。养羊业是我国畜牧业的传统产业，细毛羊在我国养羊业中占重要位置，细毛羊是兵团畜牧业的主要畜种，也是兵团畜牧经济中最具特色和代表性的优势产业。我国人口众多，又是世界服装出口大国，细毛羊业的发展与我国畜牧业和纺织业的经济效益和市场竞争力密切相关，影响着区域经济的发展和社会稳定。培育成功的中国美利奴细毛羊享誉国内外。细毛羊业的发展为优化兵团农业结构，促进毛纺工业发展，提高畜牧业整体效益，以及加快养羊良种化进程都做出了重大贡献。我国是世界上消耗羊毛最多的国家，羊毛的自给率仅为1/3，供求缺口很大，每年需要从国外进口大批细羊毛，总价值达到60亿美元左右，其中大部分是细绵羊毛和超细绵羊毛。近年来，随着毛纺产品向自然、舒适、轻薄、柔软的方向发展，世界羊毛品质也出现了划时代的变革，主要表现在羊毛细度上。中国对进口羊毛品质和细度的要求越来越高，我国和澳大利亚双边羊毛贸易的品质结构以羊毛细度作为标准，羊毛细度是体现加工价值的一个重要的指标，过去毛纺部门需求毛细度以60 64支为主，近年来66 70支羊毛的需求不断增加，羊毛越细，加工附加值越高。中国美利奴羊(新疆军垦型)的培育从1972年开始，刘守仁等在新疆生产建设兵团协作组以紫泥泉种羊场为育种场在短期内通过级进杂交方法成功培育中国美利奴羊(新疆军垦型)。分为六个品系，分别为军垦A型品系、军垦B型品系、超细型品系、肉用多胎品系、 毛用多胎品系、U品系。A品系具有体格大，产毛量高，毛密的特点。B品系具有毛长，羊毛品质好的特点。超细毛品系具有毛细的特点，主体细度达到15 18 μ m (80 90支)。肉用多胎品系兼具肉品质好和繁殖率高的特点。毛用多胎品系兼具毛品质好和繁殖率高的特点。截止2002年已向全国23个省、自治区推广优质种羊12万只，为我国细毛羊事业的发展和改良工作做出了重大贡献。但是，如何进一步提高羊毛细度，培育超细毛种羊，以及快速扩大种群规模仍然是一个重要问题。分子标记技术能够在种羊选育中避免年龄、性别、环境的干扰，实现早期、快速、准确的选择优质细毛羊，组建并扩大优质细毛羊种群。因此，寻找羊毛细度(毛纤维直径)相关基因及分子标记，应用现代分子育种新技术快速培育超细毛羊、快速扩大优质细毛羊种质规模势在必行。研究表明，羊毛纤维的复杂结构主要由角蛋白家族组成。这些蛋白对于羊毛纤维的机械性能和主要构造起主要作用。羊毛纤维主要由三部分组成角质层、皮质层和一少部分有髓粗毛组成。羊毛纤维的90%由皮质层组成，皮质层由嵌入角蛋白关联蛋白-KAPs 里面的丝状的微纤维组成。微纤维包括角蛋白中间丝蛋白，而角蛋白中间丝蛋白是我们已知的“硬” a -角蛋白。这些角蛋白是低硫蛋白，由两个蛋白家族构成，分别是I型角蛋白和II型角蛋白。根据氨基酸组成，KAPs分成三类高硫角蛋白关联蛋白(KAP1. η、ΚΑΡ2. η、 ΚΑΡ3. η)，超高硫角蛋白关联蛋白(ΚΑΡ4. η、ΚΑΡ5. ικΚΑΡΙΟ. η)和高甘氨酸-酪氨酸角蛋白关联蛋白(ΚΑΡ6. η、ΚΑΡ7. η、ΚΑΡ8. η)。KAP基因大多为小片段，大小一般在0. 6Kb 1. 5Kb之间，并且都不含内含子。在羊毛纤维蛋白中有很多变异，尤其对于基质蛋白，尽管在数千年针对羊毛纤维的品质选育中，变异逐渐减少，但是，毛纤维异质性仍然存在。很多研究报道角蛋白和KAP 基因家族存在多态性。角蛋白及亚家族编码基因存在多个插入/缺失和单核苷酸(SNP) 突变，这些基因多样性与羊毛性状(细度、强度、弹性和弯曲度等)存在相关关系(管峰等， 2007)。羊毛细度是一个高遗传力性状，达到0. 59，但在不同绵羊品种间略有差异(Safari 等，2007)，同时羊毛纤维的细度是一个复杂的调控过程，受到多种影响因素的调控和制约， 与体重、体脂含量、繁殖率等也存在相互制约关系。最近在KAP1. 1、KAP1.3基因编码区发现了多个SNP位点，但是和羊毛性状之间的关系尚需进一步研究(Itenge-Mweza等，2007)。刘桂芬等(2005)用微卫星标记对新疆优质细毛羊进行专门的遗传多样性及羊毛细度候选基因进行分析，选择21号染色体上高硫蛋白家族中KAP1. UKAP1. 3中的部分序列和1号染色体高甘氨酸一酪氨酸蛋白KAP6. 1的外显子进行研究，结果发现KAP1. 1、KAP1. 3所在区域中位点W08667与羊毛细度相关(P<0. 05)。张亚妮等研究了 KAP基因与内蒙古绒山羊经济性状的关系得出KAP基因的部分位点与绒细度存在相关。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种操作简单、成本低、精确度高的采用PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测绵羊毛纤维直径，从而预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方法。本专利技术通过以下技术方案实现，其特征主要包括以下步骤 (1)根据绵羊KAP1. 1基因序列设计一对引物 KFl: <210>1 ； KRl: <210>2。(2)从绵羊血液中提取基因组DNA，利用该引物对绵羊的基因组DNA进行PCR扩增；(3)使用聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行电泳分离，检测出KAP1.1基因外显子中的 60bp和30bp插入/缺失的变异位点；(4)多态性分析当绵羊KAP1.1基因外显子缺失60bp时，PCR扩增片段长度为^lbp, 将其命名为CC基因型；当绵羊KAP1. 1基因外显子缺失30bp时，PCR扩增片段长度为311bp， 将其命名为BB基因型；当绵羊KAP1. 1基因外显子含有60bp和30bp插入时，PCR扩增片段长度为341bp，将其命名为AA基因型；该位点杂合的个体PCR扩增产物为两条带，分别为 341bp和311bp，将其命名为AB基因型；341bp和281bp，将其命名为AC基因型；311bp和5^lbp,将其命名为BC基因型。实验证明具有BB基因型绵羊的平均毛纤维直径显著小于具有AA、BC、AC、AB和CC 基因型绵羊的平均毛纤维直径(P<0. 05)。其中用于分析多态性的位点选自绵羊KAP1. 1基因如下序列中的60个和30个碱基的插入/缺失，1 caaccctcct ctcaacccaa ctcctgacac catggcctgc tgttccacca gcttctgtgg 61 atttcccatc tgttccactg gtgggacctg tggctccagt ccctgccagc agacctgctg 121 ccagaccagc tgctgccagc caacctccat ccagaccagc tgctgccagc caacttccat 181 ccagaccagc tgctgccaac cga(tctccat ccagaccagc tgctgccagc caa)cctccat 241 ccagaccagc tgctgcca本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方法，其特征主要包括以下步骤：（１）根据绵羊ＫＡＰ１．１基因序列设计一对引物：ＫＦ１： （２１０）１，ＫＲ１： （２１０）２；（２）从绵羊血液中提取基因组ＤＮＡ，利用该引物对绵羊的基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增；（３）使用聚丙烯酰胺凝胶对ＰＣＲ产物进行电泳分离，检测出ＫＡＰ１．１基因外显子中的６０ｂｐ和３０ｂｐ插入 ／ 缺失的变异位点；（４）多态性分析：当绵羊ＫＡＰ１．１基因外显子缺失６０ｂｐ时，ＰＣＲ扩增片段长度为２８１ｂｐ，将其命名为ＣＣ基因型；当绵羊ＫＡＰ１．１基因外显子缺失３０ｂｐ时，ＰＣＲ扩增片段长度为３１１ｂｐ，将其命名为ＢＢ基因型；当绵羊ＫＡＰ１．１基因外显子含有６０ｂｐ和３０ｂｐ插入时，ＰＣＲ扩增片段长度为３４１ｂｐ，将其命名为ＡＡ基因型；该位点杂合的个体ＰＣＲ扩增产物为两条带，分别为３４１ｂｐ和３１１ｂｐ，将其命名为ＡＢ基因型；３４１ｂｐ和２８１ｂｐ，将其命名为ＡＣ基因型；３１１ｂｐ和２８１ｂｐ，将其命名为ＢＣ基因型，具有ＢＢ基因型绵羊的平均毛纤维直径显著小于具有ＡＡ、ＢＣ、ＡＣ、ＡＢ和ＣＣ基因型绵羊的平均毛纤维直径。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨华，
申请(专利权)人：新疆农垦科学院，
类型：发明
国别省市：65
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