一种绝对荧光定量ＰＣＲ检测方法技术

一种绝对荧光定量ＰＣＲ检测方法，是将双链的线性质粒稀释成不同浓度作为标准品，将单链的ｃＤＮＡ待测样品先扩增一次得到双链的ｃＤＮＡ待测样品，以双链的ｃＤＮＡ待测样品和双链的线性质粒标准品同时进行荧光定量ＰＣＲ反应，得出每个拷贝数所对应的Ｃｔ值，以标准品拷贝数的对数值为横坐标，测得的每个拷贝数所对应的Ｃｔ值为纵坐标得到标准曲线，将待测样品的Ｃｔ值带入标准曲线中，得到待测样品的起始拷贝数。本发明专利技术的的绝对荧光定量ＰＣＲ检测方法能够更真实的测定目的片段的绝对拷贝数，使测得的结果更加准确。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及定量PCR技术，特别是涉及一种绝对荧光定量PCR检测方法。
技术介绍
实时荧光定量PCR技术(Real-time Quantification PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光定量PCR技术包括相对荧光定量PCR和绝对荧光定量PCR。 绝对荧光定量PCR (absolute quantification PCR, AQ-PCR)技术是利用已知起始拷贝数的标准样品作出标准曲线，通过测定未知样品的以值，从标准曲线上计算出该样品的起始浓度，可以实现对测定样本基因mRNA分子拷贝数的绝对定量。而相对荧光定量PCR技术只是测定样本中的靶序列相对于参照样本量的变化，而不能测出初始模板起始拷贝数的绝对量。绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数量，相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，因此不需要得出它们在每个样本中的绝对拷贝数。相比而言，绝对定量的优点在于(1)可以得到基因mRNA表达的绝对数，这对于一些生物检验检测十分重要；( 不同实验结果可以相互进行对比。其缺点是绝对标准品的制备比较困难，技术水平要求较高。目前，我国研究基因表达大多采用相对荧光定量PCR技术，而在国外应用绝对荧光定量PCR测定基因表达技术方法已经比较成熟。制备标准曲线的是绝对荧光定量PCR测定基因的关键步骤。常用的质粒制备标准曲线方法是先将测定基因的目的片段克隆到质粒中，测定质粒浓度，计算其拷贝数，稀释成不同浓度的标准品，依据这一系列标准品的以值得出标准曲线。测定样品时，标准品与未知样品同时进行PCR循环，根据未知样品的Ct值，结合标准曲线来求得未知样品cDNA的起始拷贝数。这种用质粒来制备标准曲线的方法可能存在一定的弊端。首先，质粒是环状的， 环状的质粒有可能影响到荧光定量PCR体系的优化；其次，质粒为双链DNA，未知样品cDNA 为单链DNA，用来构建标准曲线的目的基因片段是连接在环状质粒上的，当进行绝对荧光定量PCR反应时，环状和线性空间结构的差异将会影响到PCR的扩增效率。一些分子实验已经表明环状质粒和线性质粒有很大的区别。质粒的双链DNA、未知样品cDNA的单链DNA同时进行PCR反应，在质粒第一个循环扩增时，上下游引物均可以结合质粒模板DNA，而测定样品单链cDNA第一个循环扩增时，只有上游引物中可以结合测定样品cDNA，扩增出基因的正义链片段，第二个循环扩增时，cDNA才开始双链的扩增，而此时质粒已经扩增为四条核苷酸链，所以，质粒和样品cDNA在进行绝对荧光定量PCR所扩增的模板数是不同步的，会导致通过标准曲线测得的未知样品起始拷贝数数值比实际偏小。这个问题对于相对定量是没有影响的，因为相对荧光定量PCR的目的是比较几种样品的相对性，基因表达量的相对比值是不变的。而绝对荧光定量PCR的方法是测出未知样品的起始拷贝数，结果偏小了就不能反映出实验的真实性，准确性。绝对荧光定量PCR制备标准曲线另一种方法是在质粒载体上用T7或SP6RNA聚合酶的启动子来亚克隆复制子，转录成cRNA，用核酸微量测定仪测定cRNA的浓度，并按照公式:N (molecules/μ 1) =C (cRNA μ g/μ 1) X 182. 5 X 1013/Κ (fragment size/bp)测出 cRNA 的拷贝数。以10倍浓度梯度稀释cRNA样品，开始实时定量RT-PCR测出每个浓度标准品的以值，以以值为纵坐标，cRNA模板数的对数为横坐标绘制标准曲线。未知样品进行RT-PCR 后，根据其以值重合在标准曲线上的位置可计算出样品的准确浓度。这种方法保证了建立标准曲线所使用的cRNA模板与未知样品cDNA都是单链，可以同步进行PCR反应，Gilbert 等人采用此方法测定了肉鸡小肠中营养转运因子基因的表达变化。但用这种方法制备标准曲线比较繁琐，进行体外转录技术水平要求很高。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种绝对荧光定量PCR检测方法，以消除用质粒制备绝对定量PCR标准曲线存在的标准品双链环状质粒分子与待测样品单链线性cDNA分子结构之间的差异，确保绝对荧光定量PCR测定方法的准确性。为解决上述问题，本专利技术提供的绝对荧光定量PCR检测方法如下(1)提取样品总RNA；(2)将(1)提取的总RNA进行反转录和基因片段扩增，得到单链的cDNA待测样品；(3)将O)的cDNA待测样品进行纯化，利用纯化的cDNA制备带有EcoRI酶切位点的重组质粒；(4)EcoRI酶切(3)获得的质粒，得到双链的线性质粒；(5)计算(4)质粒的拷贝数，以此作为标准品；(6)将标准品稀释成不同梯度浓度，作为模板进行荧光定量PCR反应，反应完成后，得出每个拷贝数所对应的Ct值，以标准品拷贝数的对数值为横坐标，测得的每个拷贝数所对应的Ct值为纵坐标，得到标准曲线；(7)按照(6)中的PCR反应体系，将cDNA待测样品在荧光定量PCR仪中先扩增一次，得到双链的cDNA待测样品；(8)将双链的cDNA待测样品按照(6)的荧光定量PCR反应方法进行扩增，反应完成后， 得出其所对应的以值；(9)将待测样品的以值带入步骤(6)的标准曲线中，得到待测样品的起始拷贝数。其中，上述检测方法中，双链的cDNA待测样品与双链的线性质粒标准品是同时进行荧光定量PCR反应的。本专利技术的的绝对荧光定量PCR检测方法主要进行了两个改进1)用酶切的方法使环状质粒线性化，用线性质粒制备标准曲线；2)将未知样品cDNA先扩增出一条正义链， 再与作为标准曲线的质粒标准品同时开始荧光定量PCR循环。经过上述改进，本专利技术的绝对荧光定量PCR检测方法能够更真实的测定目的片段的绝对拷贝数，使测得的结果更加准确。本专利技术的的绝对荧光定量PCR检测方法标准曲线制备简单，具有较高的准确性和灵敏性，适用于绝对荧光定量PCR定量分析，易于推广应用。具体实施方式实施例1。以在鸡胃肠道发育和分化中起重要作用的似(GATA binding protein 5)基因表达为例，以绝对荧光定量PCR检测方法测定目的片段的起始绝对拷贝数。1)、以常规方法提取出样品的总RNA。2)、Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)在线设计合成似7 5" 基因PCR克隆引物，上游引物5 ‘ -3 ‘ AACCCCAGAAGAGGCTGTCT,下游引物5 ‘ -3 ‘ TGGGAGAAAAGGGGTAGTCC，扩增产物长度432bp。反转录在25 μ L体系中进行，根据反转录试剂盒进行操作，产物置_20°C保存。进行cDNA PCR反应，反应体系为cDNA模板4 μ L，IOXPCR 缓冲液 8 μ L，dNTPs 6. 4μ L (2· 5 讓 ol/L)，0· 8 μ L 克隆上游引物(5 μ mol/L)和 0· 8 μ L 克隆下游引物(5ymol/L)，rTaq酶1.6yL，ddH20 58. 4 μ L，总体积80 μ L。PCR反应程序为 94°C预变性5分钟，94°C变性1分钟，65 °C退火30秒，72 °C延伸1分钟，完成35个循环本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种绝对荧光定量ＰＣＲ检测方法，其方法如下：（１）提取样品总ＲＮＡ；（２）将（１）提取的总ＲＮＡ进行反转录和基因片段扩增，得到单链的ｃＤＮＡ待测样品；（３）将（２）的ｃＤＮＡ待测样品进行纯化，利用纯化的ｃＤＮＡ制备带有ＥｃｏＲⅠ酶切位点的重组质粒；（４）ＥｃｏＲⅠ酶切（３）获得的质粒，得到双链的线性质粒；（５）计算（４）质粒的拷贝数，以此作为标准品；（６）将标准品稀释成不同梯度浓度，作为模板进行荧光定量ＰＣＲ反应，反应完成后，得出每个拷贝数所对应的Ｃｔ值，以标准品拷贝数的对数值为横坐标，测得的每个拷贝数所对应的Ｃｔ值为纵坐标，得到标准曲线；（７）按照（６）中的ＰＣＲ反应体系，将ｃＤＮＡ待测样品在荧光定量ＰＣＲ仪中先扩增一次，得到双链的ｃＤＮＡ待测样品；（８）将双链的ｃＤＮＡ待测样品按照（６）的荧光定量ＰＣＲ反应方法进行扩增，反应完成后，得出其所对应的Ｃｔ值；（９）将待测样品的Ｃｔ值带入步骤（６）的标准曲线中，得到待测样品的起始拷贝数。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李慧锋，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：14