用以提升核苷酸类似物并入的重组DNA聚合酶制造技术

本申请提供一种组合物，其包含重组DNA聚合酶与3’‑酯化核苷酸类似物。所述重组DNA聚合酶的氨基酸序列与9°N DNA聚合酶(SEQ ID NO:1)有至少90％的同源性，且所述重组DNA聚合酶包含在对应于9°NDNA聚合酶氨基酸残基141与143位置的至少二个突变。本申请还提供一种重组DNA聚合酶。所述重组DNA聚合酶的氨基酸序列与9°N‑IIIDNA聚合酶(SEQ ID NO:3)有至少90％的同源性，且该重组DNA聚合酶包含在对应于9°N‑III DNA聚合酶氨基酸残基480与486位置一个或二个突变。本申请还提供了一种进行聚合反应的方法。

Recombinant DNA polymerase used to enhance nucleotide analogues incorporation

The present invention provides a composition comprising a recombinant DNA polymerase and a 3 '- Esterified nucleotide analogue. The amino acid sequence of the recombinant DNA polymerase has at least 90% homology with the 9 degree N DNA polymerase (SEQ ID NO:1), and the recombinant DNA polymerase contains at least two mutations corresponding to the 141 and 143 position of the 9 degree NDNA polymerase amino acid residues. This application also provides a recombinant DNA polymerase. The amino acid sequence of the recombinant DNA polymerase has at least 90% homology with the 9 degree N IIIDNA polymerase (SEQ ID NO:3), and the recombinant DNA polymerase contains one or two mutations corresponding to the 9 degree N III DNA polymerase amino acid residues 480 and 486. This application also provides a method for polymerization.

【技术实现步骤摘要】
用以提升核苷酸类似物并入的重组DNA聚合酶相关申请的交叉引用本申请要求2016年11月1日提出的美国临时申请第62/415,686号的优先权，在此将其全文引入。
本专利技术涉及用以提升核苷酸类似物并入的重组DNA聚合酶。
技术介绍
所有生物体都使用DNA聚合酶以复制并保持其基因组。DNA聚合酶借由检测碱基对间的互补性以及识别碱基对的额外结构特征，以使DNA复制过程能保持高度的保真度。依其氨基酸与大肠杆菌(E.Coli)DNA聚合酶I、II与III之间的同源性，将DNA聚合酶分成三种主要的超级家族。这三大类分别称为A、B及C家族聚合酶。A与B家族聚合酶的核苷酸结合部位有共同的结构核心。早期针对DNA聚合酶的实验显示，难以并入经修饰的核苷酸，如二脱氧核苷酸(dideoxy-nucleotides,ddNTPs)。因此，已有一些先例是经由修饰DNA聚合酶以提升核苷酸类似物的并入率。相关领域需要开发出一种重组DNA聚合酶，其能够并入3'-酯化核苷酸类似物或其磷酸基接有淬灭剂的3’-酯基-染料，如3'-酯基-染料/5'-Q，其中Q表示淬灭剂。
技术实现思路
本申请提供一种组合物，其包含：衍生自B家族DNA聚合酶的一种DNA聚合酶，其对于用于DNA链延长的天然核苷酸或其类似物拥有3'编辑活性；以及核苷酸类似物，该核苷酸类似物的3'位置经过修饰。非必要地，所述核苷酸类似物的5'位置上也经过修饰。具体来说，本申请利用9°N与KOD1DNA聚合酶以并入3'-酯化核苷酸类似物。所述的9°N与KOD1DNA聚合酶能够并入3'-酯基-染料核苷酸类似物，且在并入该核苷酸类似物之后，能够移除该染料。因此，可以依次并入多个核苷酸类似物。更有甚者，该9°N与KOD1DNA聚合酶可依次并入其磷酸基接有淬灭剂的3'-酯基-染料，如3'-酯基-染料/5'-Q。在第一方面中，本申请提供一种组合物，其包含一重组DNA聚合酶与3’-酯化核苷酸类似物，其中该重组DNA聚合酶的一氨基酸序列与9°NDNA聚合酶(SEQIDNO:1)有至少90％的同源性，且该重组DNA聚合酶包含对应于该9°NDNA聚合酶的氨基酸残基141与143位置的至少二个突变。在第二方面中，本申请提供一种重组DNA聚合酶，其包含一氨基酸序列，其与9°N-IIIDNA聚合酶(SEQIDNO:3)有至少90％的同源性，且该重组DNA聚合酶包含对应于该9°N-IIIDNA聚合酶的氨基酸残基480与486位置的一个或二个突变。在第三方面中，本申请提供一种用以进行聚合反应的方法，其包含以下步骤：(a)提供一组合物，其包含一核酸模板、一本专利技术所述的DNA聚合酶以及选择性的一引物；(b)使该组合物与一3’-酯化核苷酸类似物接触，其中该3’-酯化核苷酸类似物包含通过一酯键而连接到3’端的一连接物；(c)允许该DNA聚合酶以一模板依赖性的方式，将该3’-酯化核苷酸类似物并入一新生链中；以及(d)允许该DNA聚合酶由该新生链移除所并入的3’-酯化核苷酸类似物的该连接物。附图说明图1A为MALDI-TOFMS分析图，图中显示利用3’-AL核苷酸进行单一碱基引物延伸的结果。以3’-AL沿着适当引物-模板进行反应可产生具有预期质量(N-dAL为7989m/z)的单一碱基延伸产物。图中标记出引物(N)与延伸产物的波峰。图1B显示9°N-I和引物(P)-模板(T)DNA与3’-AL在并入后的二元结构。图1C为9°N-I二元结构的活性位点的卡通图式，图中显示dAL通过该碱基上方的连接物部分而与该引物连接。图2为MALDI-TOFMS分析图，图中显示利用天然与经修饰核苷酸进行多碱基引物延伸的结果。以所述核苷酸沿着适当引物-模板进行反应，分别可产生具有预期质量的多碱基延伸产物。图中标记出引物(N)与延伸产物的波峰。(A、F、K、P)显示将多个碱基并入各个引物-模板DNA。(B-E)分别以9°N-I、9°N-IY409A与9°N-III催化所得的延伸产物，其具有dATP和经修饰dATP(3’-AL、3’-Aa与5’Q-3’-Aa)的预期质量。(G-J)分别以9°N-I、9°N-IY409A与9°N-III催化所得的延伸产物，其具有dTTP和经修饰dTTP(3’-TL、3’-Ta与5’Q-3’-Ta)的预期质量。(L-O)分别以9°N-I、9°N-IY409A与9°N-III催化所得的延伸产物，其具有dCTP和经修饰dCTP(3’-CL、3’-Ca与5’Q-3’-Ca)的预期质量。(Q-T)分别以9°N-I、9°N-IY409A与9°N-III催化所得的延伸产物，其具有dGTP和经修饰dGTP(3’-GL、3’-Ga与5’Q-3’-Ga)的预期质量。图3A为并入后的经修饰核苷酸的荧光偏振(fluorescencepolarization,FP)活性。图中分别显示在有Mn2+与Mg2+的情形下，由9°N-IY409A催化的3’-Na的FP活性。图3B为并入后的经修饰核苷酸的荧光偏振(fluorescencepolarization,FP)活性。图中分别显示在有Mn2+与Mg2+的情形下，由9°N-III催化的5’Q-3’-Na的FP活性。图3C分别显示在有Mn2+与Mg2+的情形下，由9°N-IY409A催化的3’-Na的FP活性呈现时间相关性的增加。图3D分别显示在有Mn2+与Mg2+的情形下，由9°N-III催化的5’Q-3’-Na的FP活性呈现时间相关性的增加。图4A为由8种DNA聚合酶催化dCTP与3’-CL的聚合酶终点(polymeraseend-point,PEP)鉴别曲线与结果。图4B为由Bst-Lg、THN以及Klenow催化dATP与3’-AL的PEP鉴别曲线与结果。图4C为由Bst-Lg、THN以及Klenow催化dTTP与3’-TL的PEP鉴别曲线与结果。图4D为由Bst-Lg、THN以及Klenow催化dCTP与3’-CL的PEP鉴别曲线与结果。图4E为由Bst-Lg、THN以及Klenow催化dGTP与3’-GL的PEP鉴别曲线与结果。图5A为由9°N-III催化dATP与5’Q-3’-Aa的PEP鉴别曲线与结果。图5B为由9°N-III催化dTTP与5’Q-3’-Ta的PEP鉴别曲线与结果。图5C为由9°N-III催化dCTP与5’Q-3’-Ca的PEP鉴别曲线与结果。图5D为由9°N-III催化dGTP与5’Q-3’-Ga的PEP鉴别曲线与结果。图6显示dATP和3’-AL与Bst-Lg在含有12T同型聚合序列(homopolymericsequence)的DNA模板上的引物延伸。图7A显示分别在pH7.5、8.0与8.8下，由9°N-I催化的3’-NL、3’-Na与5’Q-3’-Na核苷酸的DNA延伸。图7B显示分别在pH7.5、8.0与8.8下，由9°N-III催化的3’-NL、3’-Na与5’Q-3’-Na核苷酸的DNA延伸。图7C显示由9°N-I催化的综合3’-Na-d核苷酸的DNA延伸。图7D显示由9°N-III催化的综合5’Q-3’-Na,d核苷酸的DNA延伸。图8A显示由DNA聚合酶Bst-Lg、THN与Klenow催化dNTP与3’-NL的DNA持续合成能力。图8B显示本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合物，其包含一种重组DNA聚合酶及3’‑酯化核苷酸类似物，其中该重组DNA聚合酶包含一条氨基酸序列，所述氨基酸序列与9°N DNA聚合酶(SEQ ID NO:1)具有至少90％的同源性，且该重组DNA聚合酶包含对应于该9°N DNA聚合酶的氨基酸残基141与143位置的至少二个突变。

【技术特征摘要】
2016.11.01 US 62/415,6861.一种组合物，其包含一种重组DNA聚合酶及3’-酯化核苷酸类似物，其中该重组DNA聚合酶包含一条氨基酸序列，所述氨基酸序列与9°NDNA聚合酶(SEQIDNO:1)具有至少90％的同源性，且该重组DNA聚合酶包含对应于该9°NDNA聚合酶的氨基酸残基141与143位置的至少二个突变。2.如权利要求1所述的组合物，其中该重组DNA聚合酶选自由以下所组成的组：9°N-IDNA聚合酶(SEQIDNO:2)、9°N-IIIDNA聚合酶(SEQIDNO:3)、KOD1DNA聚合酶(SEQIDNO:4)、KODexo-DNA聚合酶(SEQIDNO:5)及其组合。3.如权利要求1所述的组合物，其中在该氨基酸残基141位置的突变为D141A，以及在该氨基酸残基143位置的突变为E143A。4.如权利要求1所述的组合物，其中该重组DNA聚合酶还包含对应于该9°NDNA聚合酶的氨基酸残基480与486位置的一个或二个突变。5.如权利要求4所述的组合物，其中在该氨基酸残基480位置的突变为D480A、D480C、D480F、D480G、D480H、D480I、D480M、D480N、D480P、D480Q、D480R或D480S。6.如权利要求4所述的组合物，其中在该氨基酸残基486位置的突变为I486A、I486F、I486G、I486H、I486L、I486M、I486P、I486R、I486V、I486W或I486Y。7.如权利要求1所述的组合物，其中该重组DNA聚合酶还包含位于该9°NDNA聚合酶的氨基酸残基282、325、408或410位置的至少一突变。8.如权利要求7所述的组合物，其中在该氨基酸残基282位置的突变为V282F或V282G。9.如权利要求7所述的组合物，其中在该氨基酸残基325位置的突变为E325A、E325M或E325S。10.如权利要求7所述的组合物，其中在该氨基酸残基408位置的突变为S408F或S408Y。11.如权利要求7所述的组合物，其中在该氨基酸残基410位置的突变为V410A、V410G、V410I或V410P。12.如权利要求1所述的组合物，其中该3’-酯化核苷酸类似物为3’-酯化核苷酸、3’-酯基-染料类似物或其磷酸基接有淬灭剂的3’-酯基-染料类似物(3’-酯基-染料/5’-Q)。13.如权利要求12所述的组合物，其中该3’-酯基-染料/5’-Q有化学式(I)所示结构：其中m为整数且1≦m≦10，L为该连接物基团；Rm与Rm+1随m不同而改变，且当m大于1时，Rm为一组范围涵盖R1至Rm的官能团，各Rm可独立地为氢(H)或由一个连接物基团Lm与一个Fm组成的一个官能团，而Rm+1可为氢(H)或由一个连接物基团Lm+1与该Fm+1所组成的一个官能团；该F、Fm或Fm+1可独立地为一个荧光染料或一个淬灭剂；该连接物基团Lm或Lm+1独立地选自烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、聚乙二醇、酯基、氨基、磺酰基或其组合；B为一个碱基，其选自腺嘌...

【专利技术属性】
技术研发人员：林吴宣炜，蔡经纬，蔡廷岳，黄钧源，潘诏智，张立奇，黄清龙，
申请(专利权)人：PGI股份有限公司，
类型：发明
国别省市：开曼群岛,KY