一种罗非鱼抗病免疫基因重组蛋白的制备与应用制造技术

本发明专利技术提供一种罗非鱼抗病免疫基因重组蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；上述基因的核苷酸序列，其一种为SEQ ID NO:2。本发明专利技术重组蛋白用于制备抑制微生物的生物制品。本发明专利技术用罗非鱼pik3r3b基因为材料首次构建了鱼类磷脂酰肌醇3激酶调节亚基基因的原核表达载体并研制了重组蛋白，该表达载体在大肠杆菌内表达稳定，重组蛋白对多种革兰氏阴性菌和阳性菌的抑菌活性明显，可以应用于鱼类等水产动物的疾病防治。本发明专利技术的技术方法也可在其它鱼类上进行推广应用。

Preparation and application of a recombinant protein of anti disease immune gene of Tilapia

【技术实现步骤摘要】
一种罗非鱼抗病免疫基因重组蛋白的制备与应用
本专利技术属于生物
中的鱼类基因工程范畴，是一种能在水产病害防治中应用的鱼类免疫基因，及该基因原核表达载体和重组蛋白的制备方法。
技术介绍
罗非鱼是世界上重要的淡水养殖鱼类，被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一。近年来，我国罗非鱼养殖业迅猛发展，养殖规模不断扩大，养殖种类不断增多，养殖产量也逐年增加，已经成为我国主导水产养殖品种之一，使得我国成为全球最大的罗非鱼出口国。但是，伴随罗非鱼养殖业快速发展的同时，越来越多的问题开始暴露出来。其中最严重的就是高密度的养殖带来了病害的频繁爆发，造成了严重的经济损失。其中影响最为严重的就是链球菌引起的细菌性病害，常常导致罗非鱼30-60％的死亡率。药物虽然短时间内可以在一定程度上防治病害，但也会带来一些弊端，例如长期频繁使用抗生素及其它一些化学药物会引起病原物产生耐药性，药物在鱼类体内残留及对水环境造成污染等，对人类的生存环境和健康将会产生潜在的威胁。依靠分子育种技术培育抗病品种在近几年来经常有报导，并取得了一定的进展。依靠这种方法虽然符合水产养殖无公害绿色发展的需求，但由于育种周期较长，难以满足罗非鱼养殖产业病害防控的迫切需要。因此筛选鱼类抗病免疫基因，通过基因工程技术研制重组抗病蛋白就显得尤为重要。首先获得免疫基因，然后利用体外重组技术，获得一种能够有效抑制病原菌生长的重组蛋白，可以为鱼类抗病机理的研究和病害防治提供基因材料和方法。罗非鱼是一种世界范围的重要养殖鱼类，因此其免疫相关基因的研究已经广泛开展，迄今在罗非鱼上开展了一些免疫相关基因克隆的研究，包括主要组织相容性抗原(MHC)IIA和IIB基因的分子克隆、基因结构、表达和多态性的分析，CD59基因的分子克隆、表达分析及与无乳链球菌免疫反应的关系；CD2BP2基因的克隆与表达分析，以及CC1趋化因子的分子克隆、功能分析等研究。但这些基因都是根据其他鱼类免疫相关基因的同源序列通过同源克隆方法获得，而筛选罗非鱼自身的抗病免疫基因显得更为重要，其重组蛋白也更适合于罗非鱼的防病抗病的需要。有关一种重要的抗病免疫基因，罗非鱼磷脂酰肌醇3激酶PI3K基因克隆、表达分析、重组蛋白的制备及其抗菌活性分析的研究目前尚未见报道。本专利技术率先研究了罗非鱼PI3K基因的时空表达特征和病原菌感染前后的变化，构建了该基因的重组表达载体，建立了重组蛋白制备和抗菌活性分析方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种罗非鱼抗病免疫基因重组蛋白的制备与应用方法，其重组蛋白具有显著的抑菌活性，为鱼类抗病机理研究和抗病饲料添加剂的研制提供基因序列和方法。本专利技术首先提供一种从罗非鱼中筛选的抗病免疫基因，其氨基酸序列为SEQIDNO:1；上述基因的核苷酸序列，其一种为SEQIDNO:2；一种重组表达载体，用于重组表达上述的抗病免疫基因蛋白；所述的重组表达载体为重组原核表达载体；本专利技术还提供上述抗病免疫基因的重组蛋白，是用上述的重组表达载体转入宿主菌中表达制备的；所述的重组蛋白用于制备抑制微生物的生物制品；所述的微生物为革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和无乳链球菌)或阴性菌(大肠杆菌，假单胞菌，副溶血菌)；所述的制品，其一种为饲料添加剂；本专利技术用罗非鱼为材料首次克隆了pik3r3b基因，构建了鱼类磷脂酰肌醇3激酶调节亚基基因的原核表达载体并研制了重组蛋白，该表达载体在大肠杆菌内表达稳定，重组蛋白对多种革兰氏阴性菌和阳性菌的抑菌活性明显，可以应用于鱼类等水产动物的疾病防治。本专利技术的技术方法也可在其它鱼类上进行推广应用。附图说明图1:罗非鱼pik3r3b基因cDNA及蛋白序列，图2：pik3r3b基因在尼罗罗非鱼的组织分布图，图3：感染无乳链球菌感染后pik3r3b基因的免疫组织中表达水平分析图，图4：重组尼罗罗非鱼pik3r3b基因大肠杆菌表达载体图，图5：诱导后重组蛋白的SDS-PAGE电泳图、蛋白纯化图及纯化蛋白验证图重组蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中M代表蛋白marker；上清1，2：重组载体转化诱导后上清液电泳结果；沉淀：诱导表达后菌液中沉淀部分电泳结果；空白对照：空载体诱导表达后结果；全菌：重组载体转化诱导后结果。图6：图2.蛋白westernblot检测结果图，其中沉淀：诱导表达后菌液中沉淀部分电泳结果；上清：重组载体转化诱导后上清液电泳结果；全菌：重组载体转化诱导后结果。图7：图3.重组蛋白对大肠杆菌的抑菌活性图，图中数值为蛋白浓度，分别为0.1mg/ml-0.5mg/ml重组蛋白浓度时大肠杆菌的菌落生长状态图。图8：重组蛋白对副溶血菌抑菌效果图，图中数值为蛋白浓度，分别为0.1mg/ml-0.5mg/ml重组蛋白浓度时的菌落生长状态图。图9：重组蛋白对假单胞菌抑菌效果图，图中数值为蛋白浓度，分别为0.1mg/ml-0.5mg/ml重组蛋白浓度时的菌落生长状态图。图10：重组蛋白对金黄色葡萄球菌抑菌效果图，图中数值为蛋白浓度，分别为0.1mg/ml-0.5mg/ml重组蛋白浓度时的菌落生长状态图。图11：重组蛋白对无乳链球菌抑菌效果图，A：阳性对照组，为氨苄青霉素；B：高浓度组，为重组蛋白原液；C：低浓度组，为重组蛋白原液稀释至50％；D：阴性对照组，为PBS。图12：重组蛋白对希瓦氏菌抑菌效果图，A：阳性对照组，为氨苄青霉素；B：高浓度组，为重组蛋白原液；C：低浓度组，为重组蛋白原液稀释至50％；D：阴性对照组，为PBS。具体实施方式下面以罗非鱼pik3r3b基因的克隆和表达载体构建为例，结合附图，对本专利技术的实施方式进行详细说明。采用PCR技术，扩增了罗非鱼pik3r3b基因的开放阅读框ORF区域，并将其克隆到E1表达载体上，构建了罗非鱼pik3r3b基因的原核表达载体，将该表达载体转化大肠杆菌BL21中，进行了该基因的体外重组表达，获得了重组表达产物，重组表达产物经过GE公司His-tag亲和层析柱纯化后，获得了纯化的罗非鱼pik3r3b基因重组蛋白，重组蛋白分子量为65kD左右，采用该重组蛋白对3种革兰氏阴性菌和1种革兰氏阳性菌进行了抑菌实验，显示出明显的抑菌活性，提示该重组蛋白作为鱼类饲料添加剂在水产养殖中将具有重要的应用潜力和前景。实施例1：全长cDNA序列的克隆与结构分析1、全长cDNA序列的克隆与分析：根据我们完成的罗非鱼脾脏组织转录组测序的结果，从中找到一段罗非鱼pik3r3b基因的mRNA序列。首先根据该序列设计了一对引物(On-pik3-S：5’-CTCATCAGCCATTACAGACA-3’；Onpik3-A：5’-TACAGAGCAGGCATAGCAC-3’)，对pik3r3b基因编码区核心序列进行PCR扩增和测序验证，扩增片段长度为780bp。然后根据验证的序列，设计了4条RACE引物(Pik-GSP5-1:5’-GTTTCTGGCGAACTCCTTTATGA-3’；Pik-GSP5-2:5’-GACTCATGTCTGTAATGGCTGA-3’；Pik-GSP3-1:5’-GAACAGCCTAAAGCCTGATCTCATA-3’；Pik-GSP3-2:5’-GGGTGCTATGCCTGCTCTG-3’)，以尼罗罗非鱼cDNA为模板，用RACE技术扩增该基因的5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从罗非鱼中筛选的抗病免疫基因蛋白，其特征在于，所述的抗病免疫基因蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

【技术特征摘要】
1.一种从罗非鱼中筛选的抗病免疫基因蛋白，其特征在于，所述的抗病免疫基因蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:1。2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的抗病免疫基因蛋白。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQIDNO:2。4.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体重组表达权利要求1所述的抗病免疫基因蛋白。5.权利要求1所述的抗病免疫基因蛋白的重组表达蛋白，其特征在于，所述的重组表达蛋白是用权利要求4所述的重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈松林，孟亮，陈亚东，甘西，朱佳杰，魏敏，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37