BCR‑ABL1激酶结构域复合突变体及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种BCR‑ABL1激酶结构域复合突变体及试剂盒，突变位点位于ABL1基因，突变位点是F359C和E450A，突变体的碱基序列如SEQ ID NO：9所示，检测该复合突变的试剂盒包括多对扩增引物。该BCR‑ABL1激酶结构域复合突变的检测方法提高了分子检测水平，特别适合下一代测序平台对BCR‑ABL突变的检测，提高了分子检测水平，有效缩短患者诊断时间。

BCR ABL1 kinase domain mutants and composite Kit

The invention discloses a BCR composite ABL1 kinase domain mutants and KIT mutations in ABL1 gene and mutation site is F359C and E450A, the nucleotide sequence of the mutants such as SEQ ID NO:9 shows, the compound mutation detection kit comprises a plurality of pairs of primers. The BCR detection method ABL1 kinase domain mutation improves the composite molecular detection level, particularly suitable for the detection of BCR ABL mutation next generation sequencing platform, improve the level of molecular detection, shorten the time of diagnosis of patients.

【技术实现步骤摘要】
BCR-ABL1激酶结构域复合突变体及试剂盒
本专利技术涉及一种BCR-ABL1激酶结构域突变及检测该突变的试剂盒。
技术介绍
慢性粒细胞白血病(ChronicMyelogenousLeukemia，CML)，是一种发生于造血干细胞的血液系统恶性克隆增生性疾病。CML患者会出现Ph1染色体，表现为9号染色体上的原癌基因abl和22号染色体上的断裂点集中区bcr基因重新组合成融合基因BCR-ABL1。此融合基因产生一种新的mRNA，编码的蛋白P210具有增强的酪氨酸激酶活性，主要改变细胞的酪氨酸磷酸化水平，使细胞失去对周围环境的反应性，并抑制细胞凋亡的发生。针对BCR-ABL1蛋白的酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)是CML患者的标准疗法，伊马替尼、尼罗替尼和达沙替尼被批准用于治疗新诊断的CML患者。然而，接受TKI治疗的患者中大概有20％-30％的患者对TKI抵抗，并且通常归因于BCR-ABL1激酶结构域的点突变。三分之二的伊马替尼治疗失败患者中BCR-ABL1激酶结构域中至少出现一个突变，而在三分之一的尼洛替尼或达沙替尼耐药患者中检测出BCR-ABL1激酶结构域突变。耐药患者中BCR-ABL1激酶结构域中的单突变是常见的，但当在同一个BCR-ABL1分子中存在两个或更多的突变，定义为复合突变。研究指出BCR-ABL1复合突变可以赋予对伊马替尼和其他TKIs比单点突变更高水平的抗药性。目前检测BCR-ABL1激酶结构域突变应用最广泛的技术是桑格测序(SangerSequencing,SS)法。但SS的敏感性低(突变丰度不能小于20％)，难以精确突变频率，且无法分析多个突变点之间的亚克隆演变的关系。因此，利用有效检测手段早期有效地进行BCR-ABL1突变基因的筛查，特别是复合突变的筛查，尽早发现病情变化，及时干预或更换治疗策略对患者预后至关重要。同时这方面的复合突变发现也可能适用于是其他Ph阳性的恶性肿瘤，如急性髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病等。
技术实现思路
本专利技术提供一种新的BCR-ABL1激酶结构域突变体。本专利技术提供一种BCR-ABL1激酶结构域复合突变体，突变位点位于ABL1基因，突变位点是F359C和E450A，突变体的碱基序列如SEQIDNO：9所示。一种检测BCR-ABL1激酶结构域复合突变的试剂盒，包括检测引物：BCR-ABL融合基因1上游引物(第一检测上游引物)的序列如SEQIDNO：1所示，BCR-ABL融合基因1下游引物(第一检测下游引物)的序列如SEQIDNO：2所示；BCR-ABL融合基因2上游引物(第二检测上游引物)的序列如SEQIDNO：3所示，BCR-ABL融合基因2下游引物(第二检测下游引物)的序列如SEQIDNO：4所示。突变ABL基因1上游引物(第一验证上游引物)的序列如SEQIDNO：5所示，突变ABL基因1下游引物(第一验证下游引物)的序列如SEQIDNO：6所示；突变ABL基因2上游引物(第二验证上游引物)的序列如SEQIDNO：7所示，突变ABL基因2下游引物(第二验证下游引物)的序列如SEQIDNO：8所示；一种检测TKIs耐药性的试剂盒，能够特异性识别上述复合突变体。一种BCR-ABL1激酶结构域复合突变耐药性的体外验证方法，该方法利用构建的突变体细胞系，CCK法测定TKIs药物对细胞毒性的影响，该复合突变体表现出高度的TKI耐药性。本专利技术的有益效果是：该BCR-ABL1激酶结构域复合突变的检测方法提高了分子检测水平，特别适合下一代测序平台对BCR-ABL突变的检测，提高了分子检测水平，有效缩短患者诊断时间。附图说明图1是本申请复合突变的测序峰图；图2～图4是显示单突变体和复合突变体对三种TKI药物不同的敏感性；在48小时生长测定中，野生型BCR-ABL1(曲线E)，单突变体T315I(曲线B)、F359C(曲线C)、E450A(曲线D)以及复合突变体F359C/E450A(曲线A)对伊马替尼(图2所示)、尼罗替尼(图3所示)和达沙替尼(图4所示)的敏感性，数据为与没加药组比较的平均值±SD。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。本专利技术提供一种利用二代测序技术检测BCR-ABL1激酶结构域中复合突变的方法，并且公开一种新型的BCR-ABL1复合突变，该复合突变与药物耐药性的产生相关。而本专利技术包括检测所述复合突变的方法、基于是否存在所述复合突变的预后方法和预测对治疗反应的方法。BCR-ABL1激酶结构域中突变的检测1)检测BCR-ABL1激酶结构域中的突变：收集深圳市第二人民医院血液科收治的22例经TKIs治疗后出现一种或多种耐药的CML患者外周血样本40例。设计特异引物，对BCR-ABL1基因对应序列进行PCR扩增，并进行二代测序(next-generationsequencing，NGS)，通过生物信息学方法检测与酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)药物相关的突变体。2)验证检测的BCR-ABL1激酶结构域中的复合突变：对BCR-ABL1基因对应序列的PCR扩增产物进行Sanger测序。对测序序列进行比对分析，验证检测的突变位点。同时对PCR扩增产物通过TA克隆、并测序，验证复合突变。3)预测并验证发现的新型复合突变对药物的敏感性：构建表达该复合突变体的细胞系，并对细胞系进行相关的药物TKIs敏感试验，初步验证该复合突变赋予细胞对TKIs耐药性。实施例1：一、NGS检测BCR-ABL1激酶结构域中的突变首先将收集的40例耐药样本提取RNA，逆转录成cDNA，并对BCR-ABL1基因进行PCR扩增，其中扩增的上下游引物如表1所示。利用二代测序技术(next-generationsequencing，NGS)对扩增产物进行测序(深度均大于10000×)。NGS测序是通过增加通量反复多次扫描从而提高突变检测的灵敏度，在多种TKI治疗失败的CML患者中，NGS可以识别低于SS检测极限的低水平突变(丰度<10％-15％)，并且在许多情况下揭示复杂的克隆纹理，由此来识别复合突变。NGS检测结果显示：患者CP-05的同一标本里存在F359C和E450A两种突变，属于多重突变(表2)。表1：引物序列表1中，进行复合突变检测时，只需要用到前两对检测引物，即：BCR-ABL融合基因1引物对和BCR-ABL融合基因2引物对。后面的两对测序验证引物，即突变ABL基因1引物对和突变ABL基因2引物对，只是用于后面测序验证过程中来检测BCR-ABL1激酶结构域中的复合突变。BCR-ABL融合基因1和2为同一个基因的不同位置的两个序列。两对检测引物主要是用于检测BCR-ABL1激酶结构域中的突变，扩增的基因是BCR-ABL融合基因，检测整个BCR-ABL融合基因的突变。突变ABL基因1和2为同一个基因的不同位置的两个序列。两对测序验证引物用于后面验证检测BCR-ABL1激酶结构域中的复合突变，扩增的是ABL基因，因为本申请的复合突变位点都在ABL基因序列区内，所以只是验证了ABL的序列。二、对发现的与TKIs耐药相关的突变进行SS测序验证对NGS的结果进一步验证，对检测出突变体样本的PCR扩增产物进行Sanger测序，测序序列与GenBank数据本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种BCR‑ABL1激酶结构域复合突变体，其特征在于，突变位点位于ABL1基因，突变位点是F359C和E450A，突变体的碱基序列如SEQ ID NO：9所示。

【技术特征摘要】
1.一种BCR-ABL1激酶结构域复合突变体，其特征在于，突变位点位于ABL1基因，突变位点是F359C和E450A，突变体的碱基序列如SEQIDNO：9所示。2.一种检测BCR-ABL1激酶结构域复合突变的试剂盒，其特征在于：包括检测引物：第一检测上游引物的序列如SEQIDNO：1所示，第一检测下游引物的序列如SEQIDNO：2所示；第二检测上游引物的序列如SEQIDNO：3所示，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张巧霞，杜新，王恒，肖鸿莉，楼瑾，
申请(专利权)人：深圳市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：广东,44