建构环状模板和检测DNA分子的方法技术

本发明专利技术提供一种建构环状模板的方法，其包含制备部分双链线性DNA分子，且将部分双链线性DNA分子与能够分子内连接单链DNA分子的连接酶反应以产生部分双链环状DNA分子。检测DNA分子的方法包含以下步骤。用探针分离靶DNA分子以形成部分双链线性DNA分子。将部分双链线性DNA分子与能够分子内连接单链DNA分子的连接酶反应以产生部分双链环状DNA分子。通过使用探针作为引物来进行部分双链环状DNA分子的环状测序。

Construction of circular template and the method of detecting DNA molecules

The present invention provides a method for constructing annular template, which includes preparing part double stranded linear DNA molecules, and reacting some double stranded linear DNA molecules with ligase which is able to connect single chain DNA molecules to produce some double stranded cyclic DNA molecules. The method of detecting DNA molecules contains the following steps. A probe is used to separate the target DNA molecules to form a partial double chain linear DNA molecule. Partial double chain linear DNA molecules are reacted with ligase that can connect single chain DNA molecules in molecules to produce partial double chain ring DNA molecules. By using the probe as primers, a partial double strand ring DNA molecule is sequenced.

【技术实现步骤摘要】
建构环状模板和检测DNA分子的方法相关申请的交叉参考本申请要求2016年7月1日提交的美国临时申请第62/357,382号的优先权权益。上述专利申请的全部内容特此通过引用结合在此，且成为说明书的一部分。
本专利技术涉及建构DNA的方法和检测DNA的方法，尤其是建构环状模板的方法和检测DNA分子的方法，其中DNA分子优选为片段化DNA分子，如游离DNA分子。
技术介绍
随着精准医学的发展和个体化医学的重要性，基因测序技术将被广泛地使用。通过比较和分析个体和数据库的基因信息以检测个体的基因序列是否具有有害的基因突变，如罕见的肿瘤衍生突变。因此，可预防或在早期治疗疾病。然而，当前基因库的建构和测序方法为劳动密集型和高成本的且可能产生偏差，如扩增偏差。因此，研发新的基因测序方法以实现较高准确度、快速反应或较低成本的目的为当前急待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术提供一种建构环状模板的方法以产生用于环状扩增或环状测序的部分双链环状DNA分子。本专利技术提供一种检测DNA分子的方法，其中DNA分子优选为片段化DNA分子，如游离DNA分子。本专利技术所提供的方法具有较高准确度、快速反应、较低成本和较小偏差的优点。本专利技术所提供的方法可检测一个样品中的单链和双链DNA两者。本专利技术提供一种建构环状模板的方法且方法包含以下步骤。制备部分双链线性DNA分子，且部分双链线性DNA分子在相同链上的两端处包含单链突出部分。部分双链线性DNA分子与能够分子内连接单链DNA分子的连接酶反应以产生部分双链环状DNA分子。在本专利技术的一个实施例中，制备部分双链线性DNA分子的方法包含提供单链线性DNA分子且使探针与单链线性DNA分子杂交。在本专利技术的一个实施例中，单链线性DNA分子包含40个核苷酸到500个核苷酸长。在本专利技术的一个实施例中，探针包含20个核苷酸到120个核苷酸长。在本专利技术的一个实施例中，探针包含生物素化探针。在本专利技术的一个实施例中，在使探针与单链线性DNA分子杂交之后，通过抗生蛋白链菌素珠粒提取部分双链线性DNA分子。在本专利技术的一个实施例中，制备部分双链线性DNA分子的方法包含以下步骤。提供双链线性DNA分子。提供第一衔接子和第二衔接子，其中第一衔接子和第二衔接子具有双链部分和在一端处的单链突出部分。第一衔接子连接到双链线性DNA分子的一端且第二衔接子连接到另一端以形成部分双链线性DNA分子。第一衔接子的单链突出部分和第二衔接子的单链突出部分在部分双链线性DNA分子的相同链上。在本专利技术的一个实施例中，第一衔接子和第二衔接子在一端处包含至少20个核苷酸的单链突出部分。在本专利技术的一个实施例中，使第一衔接子或第二衔接子与生物素化标记结合，且随后通过抗生蛋白链菌素珠粒提取部分双链线性DNA分子。在本专利技术的一个实施例中，进一步包含去除不与探针杂交的单链DNA分子的步骤。在本专利技术的一个实施例中，部分双链线性DNA分子在两端处包含至少10个核苷酸的单链突出部分。在本专利技术的一个实施例中，连接酶为单链DNA连接酶。本专利技术另提供一种检测DNA分子的方法且方法包含以下步骤。用探针分离靶DNA分子以形成部分双链线性DNA分子。部分双链线性DNA分子与能够分子内连接单链DNA分子的连接酶反应以产生部分双链环状DNA分子。通过使用探针作为引物来进行部分双链环状DNA分子的环状测序。在本专利技术的一个实施例中，探针为生物素化探针，且用探针分离靶DNA分子的方法包含以下步骤。提供多种寡核苷酸。使寡核苷酸连接到靶DNA分子，其中靶DNA分子为单链线性DNA分子。使靶DNA分子扩增。使生物素化探针与靶DNA分子杂交。在本专利技术的一个实施例中，靶DNA分子从包含液体活检体或大便的临床样本提取。在本专利技术的一个实施例中，液体活检体包含血浆、唾液或尿液。基于上述，本专利技术提供一种建构环状模板的方法以用于测序，其包含提供部分双链线性DNA分子且通过使用单链DNA连接酶以产生部分双链环状DNA分子。本专利技术还提供一种检测DNA分子的方法，其包含使探针与各DNA分子的感兴趣区域杂交，通过使用连接酶，尤其是单链DNA连接酶，以产生部分双链环状DNA分子，且进行环状测序。本专利技术中所提供的建构环状模板的方法和检测DNA分子的方法具有较高准确度、快速反应或较低成本的优点。为了使得本专利技术的前述特征和优点为更可理解的，下文详细描述实施例。附图说明包含附图以提供对本专利技术的进一步理解，且附图并入在本说明书中且构成本说明书的一部分。附图说明本专利技术的实施例，且与描述内容一起用来解释本专利技术的原理。图1A-1D说明根据本专利技术的实施例的一种建构环状模板的方法。图2A-2E说明根据本专利技术的另一实施例的一种建构环状模板的方法。图3A-3C说明根据本专利技术的另一实施例的一种建构环状模板的方法。图4A-4E说明根据本专利技术的另一实施例的一种建构环状模板的方法。图5A-5E说明根据本专利技术的实施例的一种检测DNA分子的方法。附图标号说明110：单链线性DNA分子；110a：单链环状DNA分子；114：单链环状DNA分子；120：探针；122：生物素化探针；130：抗生蛋白链菌素珠粒；132：珠粒；134：抗生蛋白链菌素；140：游离DNA分子；140'：扩增子；141：靶DNA分子；142：游离DNA分子；142'：扩增子；150：寡核苷酸；200a：部分双链线性DNA分子；200b：部分双链线性DNA分子；200c：部分双链线性DNA分子；200d：部分双链线性DNA分子；200e：部分双链线性DNA分子；200f：部分双链线性DNA分子；200g：部分双链线性DNA分子；202：单链突出部分；210a：部分双链环状DNA分子；210b：部分双链环状DNA分子；210c：部分双链环状DNA分子；210d：部分双链环状DNA分子；210f：部分双链环状DNA分子；300：双链线性DNA；400：衔接子；420：衔接子；440：衔接子。具体实施方式本专利技术提供一种用于建构环状模板的方法和一种用于检测DNA分子的方法。为了有助于理解本专利技术的实施方式，提供以下定义。“环状测序”是使用环状模板的测序反应。环状测序例如包括由BGI采用的DNA纳米球测序，或由PacificBiosciences采用的SMRT测序。“连接”为在如寡核苷酸或聚核苷酸的两个核酸的末端之间形成磷酸二酯键或键联的作用。可通过酶，如DNA连接酶进行连接。“杂交(Hybridization/hybridizing)”为使如DNA或RNA的寡核苷酸或聚核苷酸黏着到与其互补的寡核苷酸或聚核苷酸的反应。“引物”为具有约10-100个核苷酸长度的短聚核苷酸。引物通过与靶标杂交结合到靶聚核苷酸或“模板”。引物优选地提供用于与靶标互补的聚核苷酸的DNA合成的起始点，其可在DNA聚合酶存在下进行。典型地添加DNA聚合酶且在引物的3′端延伸新的核苷酸。引物的3′端还作为DNA连接酶的受质。“DNA测序”为测定DNA的核苷酸的反应。举例来说，反应典型地包含黏着、延伸和检测的一组循环；序列特异性引物用于黏着；经DNA聚合酶和荧光信号标记的核苷酸用于延伸；且作为指示物的荧光信号用作检测。“生物素-抗生蛋白链菌素相互作用”用于多种核酸和蛋白质纯化方法中。生物素较小且对经生物素标记的分子的干扰极少本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种建构环状模板的方法，包括：制备部分双链线性DNA分子，其中所述部分双链线性DNA分子在相同链上的两端处包括单链突出部分；以及将所述部分双链线性DNA分子与能够分子内连接单链DNA分子的连接酶反应以产生部分双链环状DNA分子。

【技术特征摘要】
2016.07.01 US 62/357,3821.一种建构环状模板的方法，包括：制备部分双链线性DNA分子，其中所述部分双链线性DNA分子在相同链上的两端处包括单链突出部分；以及将所述部分双链线性DNA分子与能够分子内连接单链DNA分子的连接酶反应以产生部分双链环状DNA分子。2.根据权利要求1所述的建构环状模板的方法，其中制备所述部分双链线性DNA分子的步骤包括：提供单链线性DNA分子；以及使探针与所述单链线性DNA分子杂交。3.根据权利要求2所述的建构环状模板的方法，其中所述单链线性DNA分子包括40个核苷酸到500个核苷酸长。4.根据权利要求2所述的建构环状模板的方法，其中所述探针包括20个核苷酸到120个核苷酸长。5.根据权利要求2所述的建构环状模板的方法，其中所述探针包括生物素化探针。6.根据权利要求5所述的建构环状模板的方法，在使所述探针与所述单链线性DNA分子杂交之后，进一步包括通过抗生蛋白链菌素珠粒提取所述部分双链线性DNA分子。7.根据权利要求1所述的建构环状模板的方法，其中所述制备所述部分双链线性DNA分子的步骤包括：提供双链线性DNA分子；提供第一衔接子以及第二衔接子，其中所述第一衔接子以及所述第二衔接子具有双链部分以及在一端处的单链突出部分；以及将所述第一衔接子连接到所述双链线性DNA分子的一端以及将所述第二衔接子连接到另一端以形成所述部分双链线性DNA分子，其中所述第一衔接子的所述单链突出部分以及所述第二衔接子的所述单链突出部分在所述部分双链线性DNA分子的...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴梦楚，田孟崇，
申请(专利权)人：PGI股份有限公司，
类型：发明
国别省市：开曼群岛,KY