聚合酶制造技术

本发明专利技术涉及一种B家族聚合酶，其包含下述突变：A基序区中的突变，其中苏氨酸是所述A基序区的第二个氨基酸，其中所述A基序区与9°N中的408至410位氨基酸同源；如果存在于所述B家族聚合酶中则引起3’‑5’外切核酸酶活性的降低或消除的突变，其中所述聚合酶还在所述A基序区中另外包含下述突变中的一者或两者：L408Y或L408F和/或P410S或P410G。它可用于DNA测序中，并且可存在于试剂盒中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】聚合酶
本专利技术属于分子生物学领域，具体来说属于酶领域，更具体来说属于聚合酶领域。本专利技术还属于核酸测序领域。
技术介绍
本专利技术涉及聚合酶，特别是修饰的DNA聚合酶，其与对照聚合酶相比显示出修饰核苷酸的掺入改进。在本专利技术中还包括将所述修饰的聚合酶用于DNA测序、特别是下一代测序的方法。基于与大肠杆菌DNA聚合酶I、II和III的氨基酸相似性，存在三个主要的DNA聚合酶超家族。它们分别被称为A、B和C家族聚合酶。尽管A和B家族聚合酶的晶体学分析揭示出用于核苷酸结合位点的共同结构核心，但在家族内良好保守的序列基序在各家族之间仅仅微弱地保守，并且在这些聚合酶辨别核苷酸类似物的方式上存在显著差异。使用DNA聚合酶的早期实验揭示出掺入修饰的核苷酸例如双脱氧核苷酸(ddNTP)的困难性。因此，存在对DNA聚合酶进行修饰以提高核苷酸类似物的掺入速率的几个实例。这些实例大多数集中于A家族聚合酶的变体，目的是增加双脱氧核苷酸链终止物的掺入。例如，Tabor和Richardson(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)1995；92:6339)描述了将水生嗜热菌(T.aquaticus)DNA聚合酶中667位的苯丙氨酸用酪氨酸替换及其对所述DNA聚合酶辨别双脱氧核苷酸的影响。为了提高修饰核苷酸的掺入效率，利用了DNA聚合酶或对DNA聚合酶进行工程改造以使其缺少3'-5'外切核酸酶活性(命名为exo-)。9°N聚合酶的exo-变体由Perler等人1998年在US5756334中并由Southworth等人在Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)1996；93:5281中描述。Gardner和Jack(Nucl.AcidsRes.1999；27:2545)描述了在VentDNA聚合酶中增强核糖核苷酸、2'和3'脱氧核糖核苷酸和2',3'-双脱氧核糖核苷酸掺入的突变。Vent聚合酶中的两个独立的突变Y412V和A488L，提高了所述酶使用核苷酸ATP的相对活性。此外，在Y412和A488处的其他替换也提高核糖核苷酸的掺入，尽管程度较低。结论是，412位残基处的氨基酸侧链的大体积充当“空间位阻门”，阻断核糖核苷酸糖的2'-羟基接近结合位点。然而，使用虫草素(3'-脱氧腺苷三磷酸)时的速率提高仅为2倍，表明所述Y412V聚合酶变体也对3'糖羟基的缺失敏感。对于A488残基来说，活性的改变更不容易合理地说明。预测A488是远离核苷酸结合位点的点；在这里，活性的增强通过酶反应所需的活化能的改变来解释。这些Vent中的突变对应于9°N聚合酶中的Y409和A485。A488L突变的通用性已通过下述极端嗜热聚合酶中的同源突变得到确认：PfuDNA聚合酶的A486Y变体(Evans等，Nucl.AcidsRes.2000；28:1059)。在所述聚合酶基因中引入一系列随机突变，并鉴定了具有改进的ddNTP掺入的变体。与野生型相比，A486Y突变使测序梯中ddNTP/dNTP的比率提高150倍。然而，Y410向A或F的突变产生的变体与野生型酶相比，产生更差的测序梯。关于进一步信息，参考国际公开号WO01/38546。9°NDNA聚合酶的A485L变体(Gardner和Jack，Nucl.AcidsRes.2002；30:605)。这项研究证实了485位氨基酸处丙氨酸向亮氨酸的突变增强了缺少3'糖羟基部分的核苷酸类似物(acyNTP和双脱氧NTP)的掺入。TspJDF-3DNA聚合酶的A485T变体(Arezi等，J.Mol.Biol.2002；322:719)。在这篇论文中，将随机突变引入到JDF-3聚合酶中，从其中鉴定到ddNTP的掺入提高的变体。两个突变A485T和P410L与野生型酶相比，独立地提高ddNTP摄入。在组合时，这些突变具有累加效应，并使ddNTP掺入提高250倍。这篇论文证实了DNA聚合酶的两个区域的同时突变可以对核苷酸类似物掺入具有累加效应。此外，这篇报告证实了与上述Y409相邻的P410也在核苷酸糖类似物的辨别中发挥作用。WO01/23411描述了使用Vent的A488L变体将双脱氧核苷酸和无环核苷酸(acyclonucleotide)掺入到DNA中。所述申请还覆盖了利用这些核苷酸类似物和在485位残基处突变的9°NDNA聚合酶的变体的测序方法。WO2005/024010A1也涉及A基序区的修饰和9°NDNA聚合酶。然而，所述修饰目前仍未显示出足够高的修饰核苷酸掺入速率。因此，获得具有修饰核苷酸的这种高掺入速率的酶，将是有益的。
技术实现思路
为了提高某些DNA测序方法的效率，本专利技术人分析了是否可以对DNA聚合酶进行修饰以产生这些3'取代的核苷酸类似物的提高的掺入速率。本专利技术涉及包含下述突变的B家族聚合酶：A基序区中的突变，其中苏氨酸是所述A基序区的第二个氨基酸，其中所述A基序区与9°N中的408至410位氨基酸同源；如果存在于所述B家族聚合酶中将引起3’-5’外切核酸酶活性的降低或消除的突变，其中所述聚合酶还在所述A基序区中另外包含下述突变中的一者或两者：L408Y或L408F和/或P410S或P410G。本专利技术还涉及修饰的聚合酶在DNA测序中的用途和包含这种酶的试剂盒。在本文中，“掺入”意味着通过与修饰的核苷酸的5'磷酸基团形成磷酸二酯键，将所述修饰的核苷酸连接到第二个核苷酸的游离3'羟基。所述修饰的核苷酸连接到的第二个核苷酸通常出现在多核苷酸链的3'末端处。在本文中，当在本专利技术的情形中使用时，“修饰的核苷酸”和“核苷酸类似物”是指已在3'糖羟基处进行修饰，以使该取代基的尺寸比天然存在的3’羟基更大的核苷酸。这些术语可互换使用。在本文中，术语“大的3'取代基”是指在3'糖羟基处的、尺寸比天然存在的3'羟基更大的取代基。在本文中，“改进的”掺入被定义为包括与对照聚合酶相比，至少一种修饰的核苷酸的掺入效率和/或观察到的掺入速率的提高。然而，本专利技术不仅限于修饰核苷酸的绝对掺入速率的改进。正如下文所示，所述聚合酶还掺入其他的修饰和所谓的暗核苷酸(darknucleotide)，因此，“改进的掺入”应该被相应地解释为也涵盖任何这些其他性质的改进，不论掺入速率是否提高。所述“改进”不必在所有循环中都是恒定的。因此，“改进”可以是在低温下和/或在比对照酶更宽的温度范围内掺入所述修饰的核苷酸的能力。在本文中，“改进”可以是在使用较低浓度的修饰核苷酸作为底物时掺入所述修饰核苷酸的能力。优选地，当在纳摩尔范围内的底物浓度下工作时，所述改变的聚合酶应该表现出修饰核苷酸的可检测的掺入。在本文中，“改变的聚合酶”意味着所述聚合酶与对照聚合酶相比具有至少一个氨基酸改变。一般来说，这种改变包含至少一个氨基酸被另一个氨基酸替换。在某些情况下，这些改变是保守改变，以维持所述蛋白质的总体电荷分布。然而，本专利技术不仅限于保守替换。在本专利技术中也设想了非保守替换。此外，本专利技术设想了所述聚合酶中的修饰可以是从所述蛋白质缺失或向其添加一个或多个氨基酸，只要所述聚合酶与对照聚合酶相比，对于在3’糖羟基处被修饰以使该取代基的尺寸比天然存在的3’羟基更大的核苷酸的掺入来说具有改进的活性即可。在本文中，“核苷酸”被定义为包括核苷酸和核苷。核苷与本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种B家族聚合酶，其包含下述突变：A基序区中的突变，其中苏氨酸是所述A基序区的第二个氨基酸，其中所述A基序区与9°N中的408至410位氨基酸同源；如果存在于所述B家族聚合酶中将引起3’‑5’外切核酸酶活性的降低或消除的突变，其中所述聚合酶还在所述A基序区中另外包含下述突变中的一者或两者：L408Y或L408F和/或P410S或P410G。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.09 EP 15184470.11.一种B家族聚合酶，其包含下述突变：A基序区中的突变，其中苏氨酸是所述A基序区的第二个氨基酸，其中所述A基序区与9°N中的408至410位氨基酸同源；如果存在于所述B家族聚合酶中将引起3’-5’外切核酸酶活性的降低或消除的突变，其中所述聚合酶还在所述A基序区中另外包含下述突变中的一者或两者：L408Y或L408F和/或P410S或P410G。2.权利要求1的聚合酶，其中所述聚合酶选自具有突变Y409T的9°N聚合酶、具有突变Y412T的Vent聚合酶、具有突变Y410T的Pfu聚合酶、具有突变Y409T的JDF-3聚合酶和具有突变E615T的Taq聚合酶。3.权利要求1或2的聚合酶，其中所述聚合酶包含下述突变中的一者或多者：D215A和/或D315A。4.权利要求1至3任一项的聚合酶，其中所述聚合酶还包含突变A485L。5.前述权利要求任一项的聚合酶，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：拉尔夫·佩斯特，弗兰克·纳兹，尼古拉·格拉塞，安妮·斯普利斯特尔斯巴赫，西亚·吕特杰斯，
申请(专利权)人：凯杰有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE