一种靶多核苷酸编辑方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种靶多核苷酸编辑方法，具体步骤包括针对目标靶基因，设计一对DNA寡核苷酸单链，使其与靶基因的正义和反义链分别互补，分别产生能够被一类识别靶序列结构并具有切割活性的核酸酶识别的结构，通过所述的核酸酶切割靶基因组DNA，实现对基因组的编辑。其中，所述被一类识别靶序列结构并具有切割活性的核酸酶识别的结构为3'‑Flap结构，DNA寡核苷酸单链的3'末端不与靶基因互补；重组的结构识别核酸内切酶，包含结构识别功能域、DNA切割功能域、连接二者的肽段和核定位信号。

A method of target polynucleotide editing and its application

The invention relates to a target polynucleotide editing method, including the specific steps of target gene, a design of DNA single strand oligonucleotide, the target gene sense and antisense strands were complementary, respectively, can be a kind of structure identification of target sequence and has a structure of nuclease cleavage activity recognition, cutting target genomic DNA through the implementation of nuclease, the genome editing. Among them, the structure of a class of identification target sequence and has a structure of nuclease cleavage activity recognition for 3'Flap structure, 3' terminal DNA oligonucleotide is not complementary to the target gene; structure identification of recombinant endonuclease, peptide and the nuclear localization signal contains structure recognition domain, DNA domain, with cutting function two.

【技术实现步骤摘要】
一种靶多核苷酸编辑方法及其应用
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种基因组编辑方法及其应用，具体而言涉及一种对基因组进行靶向切割的技术。
技术介绍
DNA编辑在许多体外或体内的分子生物学实验中都是至关重要的。由于II型限制性内切酶(REases)对目标核苷酸精致而准确的切割，使得它们成为这些实验中不可或缺的工具。迄今为止，已有3700种II型REases已经被开发，但只有262种不同核酸序列能够被这些酶识别(S,etal.ProcNatlAcadSciUSA2007,104:10358-10363.)。因此，这些有限的序列限制了DNA编辑操作中的各种需求。为了克服此限制，已经开发了以下几种方法。第一种方法涉及对现有REases的氨基酸序列进行突变，如NotI突变体，用蛋白质结构信息学帮助增加DNA序列识别的特异性(BuchholzF.CurrOpinBiotech2009,20:383-389.)。第二种方法涉及构建一种将靶向识别结构域与DNA切割结构域结合融合的新型IIS型酶(也称为非正统酶)，如曾报道的TstI和BmrI(ChanS,etal.NucleicAcidsRes20本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶多核苷酸编辑方法，其特征在于：设计一对寡核苷酸探针，使其与靶多核苷酸的正义链和反义链分别结合，分别产生能够被核酸酶识别的目标序列结构，所述核酸酶切割靶多核苷酸，实现对靶多核苷酸的编辑。

【技术特征摘要】
1.一种靶多核苷酸编辑方法，其特征在于：设计一对寡核苷酸探针，使其与靶多核苷酸的正义链和反义链分别结合，分别产生能够被核酸酶识别的目标序列结构，所述核酸酶切割靶多核苷酸，实现对靶多核苷酸的编辑。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述靶多核苷酸是RNA或DNA，优选基因组DNA，优选所述的基因组是斑马鱼基因组、哺乳动物基因组、人类基因组、或植物基因组。3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述一对寡核苷酸探针是DNA，优选所述一对寡核苷酸探针与靶多核苷酸的结合位点间隔0-100bp，优选间隔为10-70bp、20-60bp、32-50bp或40bp。4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其中，所述寡核苷酸探针的长度为20nt以上，优选长度为20-50nt或25nt。5.如权利要求1至4任一项所述的方法，其中，所述的目标序列结构为5'突出核酸结构、3'突出核酸结构、切刻核酸结构、侵入核酸结构、三链核酸结构、Y型核酸结构、3'-Flap结构以及由错配或缺失核酸引起的鼓泡核酸结构中的至少一种的识别功能域，优选3'-Flap结构，DNA寡核苷酸单链的3'-末端不与目标基因组DNA互补。6.如权利要求5所述的方法，其中，所述寡核苷酸探针的5'端对靶多核苷酸特异，优选与靶多核苷酸互补；寡核苷酸探针的3'端不与靶多核苷酸互补，优选3'末端1个以上、1-20个、1-10个、1-5个、1-4个、1-3个、2个或1个碱基不与靶多核苷酸互补。7.如权利要求1至6任一项所述的方法，其中，所述的核酸酶是重组结构识别核酸内切酶(SGN)，包含结构识别功能域、DNA切割功能域和连接二者的肽段；所述的结构识别功能域为能够识别结构为5'突出核酸结构、3'突出核酸结构、切刻核酸结构、侵入核酸结构、三链核酸结构、Y型核酸结构、3'-Flap结构以及由错配或缺失核酸引起的鼓泡核酸结构中的至少一种的识别功能域，优选选自TaqPol、TthPol、TaqExo、AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN、MthFEN、E.coliMuts、Tthmuts和Taqmuts组成的组中任意一种酶的识别功能域或全酶片段；所述的切割功能域为IIS型核酸内切酶的切割功能域，优选FokI的部分或全部肽段；所述的切割功能域还可选自TaqPol、TthPol、TaqExo、AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN、MthFEN、E.coliMuts、Tthmuts和Taqmuts组成的组中任意一种酶的全酶片段的核酸内切酶结构域；所述的连接肽段为不影响结构识别与酶切功能的柔性肽段，优选甘氨酸或丝氨酸或其组合的串联组合。8.如权利要求7所述的方法，其中，所述的重组结构识别核酸内切酶含有核定位信号。9.如权利要求7或8所述的方法，其中，所述的重组结构识别核酸内切酶的氨基酸序列选自SEQIDNo:1、SEQIDNo:2中任一个；所述重组结构识别核酸内切酶的核酸序列选自SEQIDNo:3、SEQIDNo:4、SEQIDNo:5中任一个。10.权利要求1至9任一项所述的方法，其中，所述基因组DNA是内源DNA或整合到基因组的外源DNA，优选所述靶多核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：周国华，赵庆顺，俆澍，曹莎莎，邹秉杰，岳芸芸，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32