一种基于I‑B型CRISPR‑Cas系统基因cas3的基因编辑方法技术方案

本发明专利技术公开了一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14染色体中的I‑B型CRISPR‑Cas系统的基因

A method of I B CRISPR editor gene Cas3 gene based on Cas system

The invention discloses a I type B CRISPR Cas system Virginia Streptomyces IBL14 in chromosome based gene

【技术实现步骤摘要】
一种基于I-B型CRISPR-Cas系统基因cas3的基因编辑方法
本专利技术涉及生物
的基因编辑技术，确切地说是一种基于I-B型CRISPR-Cas系统基因cas3的基因编辑方法。
技术介绍
CRISPR-Cas系统广泛存在于古细菌和细菌基因组中。当前已发现的CRISPR-Cas系统分为两类六型：1类为多Cas蛋白进行干涉，包括I、III和IV型；2类为单一Cas蛋白进行干涉，包括II、V和VI型；I至VI型分别以Cas3,Cas9，Cas10,undetermined,Cpf1和C2c2为标志蛋白(P.Mohanraju,K.S.Makarova,B.Zetsche,F.Zhang,E.V.Koonin,J.vanderOost,DiverseevolutionaryrootsandmechanisticvariationsoftheCRISPR-Cassystems.Science2016,(353)5147)。其中，I型最为广泛，约占已鉴定的60％以上。遗憾的是：I型CRISPR-Cas系统虽有诸多发现，但未见可应用于基因编辑的报道。特别是：通过DNA导向进行基因编辑未见报道。尽管有报道介绍：极端嗜热的冰岛硫化叶菌(Sulfolobusislandicus)能利用自身I型和III型CRISPR-Cas系统通过一个基因编辑载体对自身基因组进行基因编辑(Y.Li,S.Pan,Y.Zhang,M.Ren,M.Feng,N.Peng,L.Chen,Y.X.Liang,Q.She,HarnessingTypeIandTypeIIICRISPR-Cassystemsforgenomeediting.Nucleicacidsresearch2016,(44)e34-e34)；沙黑纤毛菌(Leptotrichiashahii)中的C2c2蛋白可专一性地敲除mRNA(O.O.Abudayyeh,J.S.Gootenberg,S.Konermann,J.Joung,I.M.Slaymaker,D.B.Cox,S.Shmakov,K.S.Makarova,E.Semenova,L.Minakhin,K.Severinov,A.Regev,E.S.Lander,E.V.Koonin,F.Zhang,C2c2isasingle-componentprogrammableRNA-guidedRNA-targetingCRISPReffector.Science2016(e353)aaf5573)；环境基因组(metagenomics)中发现有可能用于基因编辑的CasX与CasY(D.Burstein,L.B.Harrington,S.C.Strutt,A.J.Probst,K.Anantharaman,B.C.Thomas,J.A.Doudna,J.F.Banfield,NewCRISPR-Cassystemsfromuncultivatedmicrobes.Nature2017,(542)237-241)。但目前证实的仅有2类的II型Cas9(化脓链球菌/Streptococcuspyogenes、空肠弯曲杆菌/Campylobacterjejuni等)和V型Cpf1(氨基酸球菌BV3L6/Acidaminococcussp.BV3L6与毛螺科杆菌MA2020/LachnospiraceaebacteriumMA2020)可对其它生物基因组进行基因编辑(P.Mohanraju,K.S.Makarova,B.Zetsche,F.Zhang,E.V.Koonin,J.vanderOost,DiverseevolutionaryrootsandmechanisticvariationsoftheCRISPR-Cassystems.Science2016,(353)aad5147；S.Shmakov,A.Smargon,D.Scott,D.Cox,N.Pyzocha,W.Yan,O.O.Abudayyeh,J.S.Gootenberg,K.S.Makarova,Y.I.Wolf,K.Severinov,F.Zhang,E.V.Koonin,Diversityandevolutionofclass2CRISPR-Cassystems.NatRevMicrobiol2017,(15)169-182)。目前主要商业应用于基因编辑的仍为II型CRISPR-Cas系统中的cas9(单基因体系)为基础所构建的基因编辑工具。维吉尼亚链霉菌IBL14是本实验室分离纯化的一株能以多种甾体化合物为唯一碳源生长的菌株；是迄今所报道的唯一能酶催化薯蓣皂苷元(diosgenin)(甾体药物的主要原料)F-环(C25羟化)反应的微生物(F.-Q.Wang,C.-G.Zhang,B.Li,D.-Z.Wei,W.-Y.Tong,NewmicrobiologicaltransformationsofsteroidsbyStreptomycesvirginiaeIBL-14.Environmentalscience&technology2009,(43)5967-5974)。菌株IBL14全基因组测序及生物信息学分析发现：该菌株存在一个I-B-svi型CRISPR-Cas系统。特别是：该系统通过一个基因编辑载体(由靶向基因片段和模板DNA组成)能对自身基因组进行基因编辑(CN201510999333.4、CN201511002817.3)；且由该系统cas7-5-3-4-1-2(6基因体系)和cas7-5-3(3基因体系)为基础所构成的编辑工具可有效的对原核生物基因组进行基因编辑(CN201611113137.3、CN201611089333.1)。由于2类II型的Cas9(4107nt)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)、CjCas9(2955nt)(E.Kim,T.Koo,S.W.Park,D.Kim,K.Kim,H.Y.Cho,D.W.Song,K.J.Lee,M.H.Jung,S.Kim,J.H.Kim,J.S.Kim,InvivogenomeeditingwithasmallCas9orthologuederivedfromCampylobacterjejuni.NatCommun2017,(8)14500)与2类V型的Cpf1(3924nt)(R.D.Fagerlund,R.H.Staals,P.C.Fineran,TheCpf1CRISPR-Casproteinexpandsgenome-editingtools.GenomeBiol2015,(16)251)存在分子量大，许多载体(如：病毒、载体等)只能搭载有限长度的片段，且存在脱靶等不足。故本专利技术将公开一个以维吉尼亚链霉菌IBL14染色体中I-B型CRISPR-Cas系统基因cas3(单基因体系)为基础设计的由Cas3表达载体(vector-cas3)和基因编辑载体(vector-t/g-geneabbreviation)组成的基因编辑系统，该基因编辑系统首次实现了基于I型CRISPR-Cas系统中单一Cas3蛋白对原核生物与真核生物基因组的基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于I‑B型CRISPR‑Cas系统基因cas3的基因编辑方法，其特征在于：包括维吉尼亚链霉菌IBL14中基因cas3构建的蛋白Cas3表达载体与包含t‑DNA和/或g‑DNA的基因编辑载体所组成的基因编辑工具对所有生物的遗传物质进行基因编辑。

【技术特征摘要】
1.一种基于I-B型CRISPR-Cas系统基因cas3的基因编辑方法，其特征在于：包括维吉尼亚链霉菌IBL14中基因cas3构建的蛋白Cas3表达载体与包含t-DNA和/或g-DNA的基因编辑载体所组成的基因编辑工具对所有生物的遗传物质进行基因编辑。2.根据权利要求1所述的一种基于I-B型CRISPR-Cas系统基因cas3的基因编辑方法，其特征在于，步骤如下：（1）Cas3表达载体的构建基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas3序列信息设计引物，以维吉尼亚链霉菌IBL14基因组为模板，通过PCR反应扩增得到cas3基因，并连接到载体上，得到Cas3表达载体；（2）基因编辑载体的构建（A）根据靶向基因序列信息设计引物，以靶向生物基因组为模板，设计并通过PCR合成由靶向基因上、下游同源臂和所需遗传功能信息组成的t-DNA片段；（B）根据生物靶向基因序列信息设计并化学合成顺序包含限制性酶缺位点、转录启动子、转录crRNA的crDNA、转录终止子和限制性酶缺位点组成的g-DNA片段；（C）分别将制备得到的t-DNA片段和g-DNA片段连接到载体上，得基因编辑载体；（3）基因编辑重组子的构建与验证制备感受态细胞或原生质体，并将步骤（1）得到的Cas3表达载体和步骤（2）得到的基因编辑载体导入感受态细胞或...

【专利技术属性】
技术研发人员：童望宇，唐严严，夏婷婷，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34