一种香蕉束顶病毒侵染性克隆及构建方法技术

本发明专利技术公开了一种香蕉束顶病毒侵染性克隆及构建方法。该侵染性克隆包含BBTV各组分的8个过环全长重组质粒，分别为pDNA‑R，pDNA‑U3，pDNA‑S，pDNA‑M，pDNA‑C，pDNA‑N，pSat4，pS2。通过转化大肠杆菌，或通过转化农杆菌后瞬时注射烟草叶片，发生同源重组进而产生≧2×大小病毒片段的重组质粒，且在香蕉体内重组为病毒并引发香蕉病变。本发明专利技术在国内外首次报道了BBTV侵染性克隆的构建，实现了BBTV侵染性克隆从无到有的过程，填补了国内外该领域的空白，为下一步BBTV蛋白基因功能、基因重组、致病机理及构建基因沉默载体等研究提供基础。

A method of infection cloning and construction of banana bundle top virus

The invention discloses a method for infection cloning and construction of banana bundle top virus. The infectious clone containing the BBTV component 8 ring full-length recombinant plasmid, respectively pDNA R, pDNA U3 pDNA, S pDNA, M pDNA, C, pDNA N, pSat4, pS2. Through the transformation of Escherichia coli, or by Agrobacterium tumefaciens after instantaneous injection of tobacco leaves, resulting in homologous recombination. The recombinant plasmid was 2 * the size of the virus fragment, and banana virus recombination in vivo and cause disease of banana. The present invention reports for the first time to construct BBTV infectious clone, realizes the BBTV infectious clone from scratch, to fill the gaps in the field at home and abroad, for the next step of BBTV gene function, gene recombination, pathogenic mechanism and gene silencing vectors and provide basic research.

【技术实现步骤摘要】
一种香蕉束顶病毒侵染性克隆及构建方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种香蕉束顶病毒侵染性克隆及构建方法。
技术介绍
香蕉束顶病(Bananabunchytopdisease,BBTD)严重威胁着世界香蕉产业的生产，包括中国南方各省。BBTD是由香蕉束顶病毒(Bananabunchytopvirus,BBTV)引起，主要靠虫媒香蕉蕉脉蚜(Pentalonianigronervosa)和香蕉种苗传播。香蕉束顶病毒属矮缩病毒科(Nanoviridae)的香蕉束顶病毒属(Babuvirus)，其基因组至少由6个环状的单链DNA组分所组成，分别包裹在病毒颗粒中。除DNA-U3组分外，其他组分均编码病毒功能蛋白，DNA-R编码复制起始蛋白(replicationinitiationprotein,Rep)，DNA-S编码外壳蛋白(capsidprotein,CP)，DNA-M编码运动蛋白(movementprotein,MP)，DNA-C编码细胞周期调控蛋白(cell-cyclelinkprotein,Clink)，DNA-N编码核穿梭蛋白(nuclearshuttleprotein,NSP)。另外，卫星组分(Satellitemolecular)作为病毒复制和侵染的非必须组分，已在部分分离物中被发现和报道，其编码辅助复制起始蛋白(assistantreplicationinitiationprotein,RepA)。目前，中国周边国家(东南亚地区)仍在流行BBTD，给我国香蕉种植业带来潜在的巨大风险。病毒重组主要以序列同源性(同源臂)为基础，将目的基因整合到病毒基因组中的基因工程技术。重组病毒的构建是建立在体外同源重组的基础上，筛选一个含亲本毒株的复制片段，通过质粒转移载体与病毒基因组DNA之间的同源重组，从而将外源基因导入病毒基因组中。病毒重组即留了亲本毒株的生物学特性，又可使重组病毒得到复制增殖。目前，该技术已广泛应用于多种类型的病毒重组，如腺病毒(Adenovirus,Adv)、猪伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PrV)、痘病毒(Poxvirus,FPV)和杆状病毒(Baculovirus)等。研究表明，多个BBTV基因组序列已分离和报道，但是在改造该病毒以及研究如何减弱其致病过程等研究尚未起步，且病毒各基因功能等方面研究也需进一步鉴定。目前，多组分环状病毒侵染性克隆构建难度较大，关键技术之一是需要合成或构建多倍性(大于病毒各组分长度1倍及以上)的过环片段，且国内外尚无BBTV侵染性克隆的相关报道。本专利技术构建的BBTV病毒侵染性克隆，可在细菌或植物体内同源重组，继而进一步产生比野生型BBTV病毒各组分环状片段大1倍的侵染性DNA克隆重组质粒，从而成功感染香蕉宿主。利用分子生物学技术和方法构建BBTV侵染性克隆，为研究BBTV复制和侵染机理，病毒蛋白基因功能，病毒与寄住互作，以及防治BBTD提供重要研究基础。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的在于提供了一种香蕉束顶病毒侵染性克隆，该克隆包括8个重组质粒，包括pDNA-R、pDNA-U3，pDNA-S，pDNA-M，pDNA-C，pDNA-N，pSat4和pS2。本专利技术的另一个目的在于提供了一种香蕉束顶病毒侵染性克隆的构建方法，方法简单。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：香蕉束顶病毒侵染性克隆，包括pDNA-R、pDNA-U3，pDNA-S，pDNA-M，pDNA-C，pDNA-N，pSat4和pS2，所述的pDNA-R是将SEQIDNO.1所示序列插入pCAMBIA3300中获得；pDNA-U3是将SEQIDNO.2所示序列插入pCAMBIA3300中获得；pDNA-S是将SEQIDNO.3所示序列插入pCAMBIA3300中获得；pDNA-M是将SEQIDNO.4所示序列插入pCAMBIA3300中获得；pDNA-C是将SEQIDNO.5所示序列插入pCAMBIA3300中获得；pDNA-N是将SEQIDNO.6所示序列插入pCAMBIA3300中获得；pSat4是将SEQIDNO.7所示序列插入pCAMBIA3300中获得；pS2是将SEQIDNO.8所示序列插入pCAMBIA3300中获得。香蕉束顶病毒侵染性克隆的构建，包括下述步骤：以感染香蕉束顶病毒的香蕉总DNA为模板，对目的片段进行扩增，具体如下：DNA-R(FJ463042)：正向引物DNA-R965F-H3，5'-AAGCTTACACGCTATGCCAATCGTACAC-3'(HindIII)，反向引物DNA-R111R-Xb，5'-CCCGGGGCGCCATTTCTGTCGACG-3'(XmaI)；DNA-U3(FJ463043)：正向引物DNA-U3840F-H3，5'-AAGCTTGCTTAGCCACGAAGGAAGG-3'(HindIII)，反向引物DNA-U3155R-Xb，5'-CCCGGGGACCTTCGGTCAAACCCAG-3'(XmaI)；DNA-S(FJ463044)：正向引物DNA-S830F-Xb，5'-CCCGGGGGTTGATTGGTCTATCGTATCGC-3'(XmaI)，反向引物DNA-S144R-H3，5'-AAGCTTGGACGGTTCCCGCCTGTT-3'(HindIII)；DNA-M(FJ463045)：正向引物DNA-M809F-H3，5'-AAGCTTCGGGGGTTGATTGGTCTATCG-3'(HindIII)，反向引物DNA-M199R-Xb，5'-CCCGGGCGGAAGTTTCCGGACGTCA-3'(XmaI)；DNA-C(FJ463046)：正向引物DNA-C858F-Xb，5'-CCCGGGGAATCGGGGGTTGATTGGGC-3'(XmaI)，反向引物DNA-C237R-H3，5'-AAGCTTCTCCTCCGATGAGTGATTTCG-3'(HindIII)；DNA-N(FJ463047)：正向引物DNA-N867F-Xb，5'-CCCGGGCGCTTAAGGGCCGCAGG-3'(XmaI)，反向引物DNA-N276R-H3，5'-AAGCTTCGCTTCTGCTTCGCATACG-3'(HindIII)；Sat4(EU430730)：正向引物Sat4914F-H3，5'-AAGCTTCGCTATGACAATCGTACGC-3'(HindIII)，反向引物Sat4111R-Xb，5'-CCCGGGCCTCGCTCCGTTGCG-3'(XmaI)；S2(L32167)：正向引物S2935F-H3，5'-AAGCTTCGCCAAGCAACCGCGTG-3'(HindIII)，反向引物S2116R-Xb，5'-CCCGGGCTCTCTCGGCTGCGGAG-3'(XmaI)。将上述各片段各插入pCAMBIA3300中，即得pDNA-R、pDNA-U3，pDNA-S，pDNA-M，pDNA-C，pDNA-N，pSat4和pS2。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：目前，国内外还未有BBTV侵染性克隆成功感染香蕉的报道，本专利技术利用常规生物技术构建了BBTV各组分的过环片段(<本文档来自技高网...

【技术保护点】
香蕉束顶病毒侵染性克隆，包括pDNA‑R、pDNA‑U3， pDNA‑S， pDNA‑M， pDNA‑C，pDNA‑N，pSat4和pS2，所述的pDNA‑R是将SEQ ID NO.1所示序列插入pCAMBIA3300中获得；pDNA‑U3是将SEQ ID NO.2所示序列插入pCAMBIA3300中获得；pDNA‑S是将SEQ ID NO.3所示序列插入pCAMBIA3300中获得；pDNA‑M是将SEQ ID NO.4所示序列插入pCAMBIA3300中获得；pDNA‑C是将SEQ ID NO.5所示序列插入pCAMBIA3300中获得；pDNA‑N是将SEQ ID NO.6所示序列插入pCAMBIA3300中获得；pSat4是将SEQ ID NO.7所示序列插入pCAMBIA3300中获得；pS2是将SEQ ID NO.8所示序列插入pCAMBIA3300中获得。

【技术特征摘要】
1.香蕉束顶病毒侵染性克隆，包括pDNA-R、pDNA-U3，pDNA-S，pDNA-M，pDNA-C，pDNA-N，pSat4和pS2，所述的pDNA-R是将SEQIDNO.1所示序列插入pCAMBIA3300中获得；pDNA-U3是将SEQIDNO.2所示序列插入pCAMBIA3300中获得；pDNA-S是将SEQIDNO.3所示序列插入pCAMBIA3300中获得；pDNA-M是将SEQIDNO.4所示序列插入pCAMBIA3300中获得；pDNA-C是将SEQIDNO.5所示序列插入pCAMBIA3300中获得；pDNA-N是将SEQIDNO.6所示序列插入pCAMBIA3300中获得；pSat4是将SEQIDNO.7所示序列插入pCAMBIA3300中获得；pS2是将SEQIDNO.8所示序列插入pCAMBIA3300中获得。2.权利要求1所述的香蕉束顶病毒侵染性克隆的构建，包括下述步骤：以感染香蕉束顶病毒的香蕉总DNA为模板，对目的片段进行扩增，具体如下：DNA-R（FJ463042）：正向引物DNA-R965F-H3，5'-AAGCTTACACGCTATGCCAATCGTACAC-3'(HindIII)，反向引物DNA-R111R-Xb，5'-CCCGGGGCGCCATTTCTGTCGACG-3'(XmaI)；DNA-U3（FJ463043）：正向引物DNA-U3840F-H3，5'-AAGCTTGCTTAGCCACGAAGGAAGG-3'(HindIII)，反向引物DNA-U3155R-Xb，5'-CCCGGGGACCTTCGGTCAAACCCAG-3'(XmaI)；DNA-S（FJ463044）：正向引物DNA-S830F-Xb，5'-CCCGGGGGTTGATTGGTCTATCGTATCGC-...

【专利技术属性】
技术研发人员：余乃通，刘志昕，刘锋，瞿玲，笈小龙，郑贤欣，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：海南,46