原代造血细胞中的蛋白递送制造技术

提供用于向细胞高效递送Cas9和Cas9核糖核蛋白的方法和组合物，所述细胞包括原代造血细胞和原代造血干细胞。

Protein delivery in primary hematopoietic cells

A method and composition for efficient delivery of Cas9 and Cas9 ribonuclein to cells, including primary hematopoietic cells and primary hematopoietic stem cells, are provided.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】原代造血细胞中的蛋白递送相关申请的交叉引用本申请要求于2015年1月30日提交的美国临时申请号62/110,187和于2015年8月25日提交的62/209,711的优先权，它们的内容通过引用完全结合在本文中用于所有目的。专利技术背景用于准确并且有效地操作原代细胞的方法、组合物、反应混合物、试剂盒和装置对于开发基于细胞的疗法以及关于体内多种细胞、组织、器官和系统的功能的基础研究具有巨大的希望。例如，近来在原代抗原特异性T细胞(primaryantigen-specificTcells)的产生和应用中的进展对针对癌症和传染病的免疫疗法具有巨大的希望。作为另一个实例，准确靶向原代细胞中的调控基因的能力能够用于研究此类调控的表型结果。专利技术简述在一方面，本专利技术涉及提供编辑细胞的基因组的方法，其中所述细胞是原代造血细胞或原代造血干细胞，所述方法包括：a)提供包含Cas9核酸酶结构域(例如，Cas9apo蛋白)和细胞的反应混合物；并且b)将所述Cas9核酸酶结构域引入到所述细胞内部，其中所述Cas9核酸酶结构域与所述细胞内的导向RNA形成复合物。在一些实施方案中，在所述细胞内的导向RNA由所述细胞内的导向RNA基因编码，其中所述导向RNA基因包含DNA。在一些实施方案中，所述细胞不包含编码Cas9核酸酶结构域的核酸。在一些实施方案中，Cas9递送的效率为至少约20％或30％。在一些实施方案中，在细胞的基因组如上文所述或本文其他地方所述进行编辑之前、过程中或之后，修饰所述原代造血细胞或原代造血干细胞以表达异源蛋白。在一些实施方案中，所述异源蛋白由病毒(例如，慢病毒)载体编码。在一些实施方案中，所述异源蛋白是嵌合抗原受体(CAR)蛋白或异源性T细胞受体(TCR)，包括，但不限于，重排的TCR。在一些实施方案中，本专利技术提供编辑细胞的基因组的方法，其中所述细胞是原代造血细胞或原代造血干细胞，所述方法包括：a)提供包含Cas9核糖核蛋白复合物和所述细胞的反应混合物，其中所述Cas9核糖核蛋白复合物包含Cas9核酸酶结构域和导向RNA，其中所述导向RNA与所述细胞基因组的靶标区域特异性杂交；并且b)将所述Cas9核糖核蛋白复合物引入到所述细胞内部。在一些实施方案中，所述方法提供至少约20％的基因组编辑效率。在一些实施方案中，所述细胞不包含编码Cas9的核酸和/或编码导向RNA的DNA核酸。在一些实施方案中，在a)的提供之前，所述细胞不被永生化或转化。在一些情形中，在b)的引入之后，所述细胞不被永生化或转化。在一些实施方案中，在a)的提供之前，所述细胞没有经过传代。在一些情形中，在a)的提供之前，所述细胞已经直接分离自宿主生物体或组织并培养。在一些情形中，在a)的提供之前，细胞已经直接分离自宿主生物体或组织但是还未进行培养。在一些实施方案中，所述引入包括电穿孔。在一些实施方案中，所述引入包括：将纳米线或纳米管用所述Cas9核糖核蛋白复合物或Cas9apo蛋白包被；使所述细胞与所述包被有Cas9核糖核蛋白复合物或Cas9apo蛋白的纳米线或纳米管接触；并且用所述包被有Cas9核糖核蛋白复合物或Cas9apo蛋白的纳米线或纳米管刺穿细胞的细胞膜。在一些实施方案中，所述引入包括：迫使所述反应混合物通过比所述细胞的直径小的细胞变形压缩物(constriction)，其中所述迫使在所述细胞的细胞膜中引入瞬时的孔；并且允许所述Cas9核糖核蛋白复合物或Cas9apo蛋白通过所述瞬时的孔进入所述细胞。在一些实施方案中，所述Cas9核糖核蛋白复合物或Cas9apo蛋白包含针对所述细胞上的细胞外受体的配体，并且所述引入包括所述Cas9核糖核蛋白复合物或Cas9apo蛋白的受体介导的内化。在一些实施方案中，所述Cas9核糖核蛋白复合物或Cas9apo蛋白包含细胞穿透肽，并且所述引入包括使所述细胞穿透肽与所述细胞接触。在一些情形中，所述电穿孔包括将反应混合物放置在位于阴极和阳极之间的室中，并且在所述阴极和阳极之间施加约20kV/m至约100kV/m的电压电位。在一些情形中，所述电压电位以具有约5ms至约100ms的持续时间的脉冲施加。在一些情形中，所述方法还包括重复施加电压电位脉冲2-10次。在一些情形中，所述室是具有纵向长度和水平横截面积的中空室；所述室包括由所述纵向长度隔开的第一和第二远端末端；并且所述室具有：在第一远端末端的第一电极；和与所述室的第二远端末端流体连通的包含电解液的储蓄池，所述储蓄池具有第二电极。在一些情形中，所述室具有在50至10,000范围内的纵向长度与水平横截面积比。在一些实施方案中，所述Cas9核糖核蛋白复合物或Cas9apo蛋白在所述反应混合物中处在约0.25μM至约5μM的浓度。在一些实施方案中，所述Cas9核糖核蛋白复合物或Cas9apo蛋白在所述反应混合物中处在约0.9μM至约1.8μM的浓度。在一些实施方案中，每微升(μL)所述反应混合物包含约1x105至约4x105个原代造血细胞或原代造血干细胞、或约0.9x104至约3.6x104个原代造血细胞或原代造血干细胞。在一些实施方案中，每微升(μL)所述反应混合物包含约2x105至约2.5x105个原代造血细胞或原代造血干细胞或1.8x104至约2.2x104个原代造血细胞或原代造血干细胞。在一些实施方案中，所述细胞是原代造血细胞。在一些情形中，所述原代造血细胞是免疫细胞。在一些情形中，所述免疫细胞是T细胞。在一些情形中，所述T细胞是调节T细胞、效应T细胞或幼稚T细胞(Tcell)。在一些情形中，所述调节T细胞、效应T细胞或幼稚T细胞是CD4+T细胞。在一些情形中，所述T细胞是CD4+CD25hiCD127lo调节T细胞。在一些情形中，所述T细胞是FOXP3+T细胞。在一些情形中，所述T细胞是CD4+CD25loCD127hi效应T细胞。在一些情形中，所述T细胞是CD4+CD25loCD127hiCD45RAhiCD45RO-幼稚T细胞。在一些情形中，所述T细胞是CD8+T细胞。在一些情形中，所述T细胞是CD4+CD8+T细胞。在一些情形中，在a)的提供之前，所述T细胞被预先活化。在一些情形中，在a)的提供之前，所述T细胞未被刺激。在一些情形中，所述T细胞包含重组抗原受体。在一些实施方案中，所述反应混合物进一步包含双链或单链的寡核苷酸DNA模板，并且其中所述方法包括将所述双链或单链的寡核苷酸DNA模板引入到所述细胞内部。在一些实施方案中，所述双链或单链的寡核苷酸DNA模板的浓度为约9μM至约180μM。在一些情形中，所述双链或单链的寡核苷酸DNA模板的浓度约为45μM。在一些情形中，所述方法提供至少约20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种编辑细胞的基因组的方法，其中所述细胞是原代造血细胞或原代造血干细胞，所述方法包括：a)提供包含Cas9核糖核蛋白复合物和所述细胞的反应混合物，其中所述Cas9核糖核蛋白复合物包含Cas9核酸酶结构域和导向RNA，其中所述导向RNA与所述细胞基因组的靶标区域特异性杂交；并且b)将所述Cas9核糖核蛋白复合物引入到所述细胞内。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.01.30 US 62/110,187;2015.08.25 US 62/209,7111.一种编辑细胞的基因组的方法，其中所述细胞是原代造血细胞或原代造血干细胞，所述方法包括：a)提供包含Cas9核糖核蛋白复合物和所述细胞的反应混合物，其中所述Cas9核糖核蛋白复合物包含Cas9核酸酶结构域和导向RNA，其中所述导向RNA与所述细胞基因组的靶标区域特异性杂交；并且b)将所述Cas9核糖核蛋白复合物引入到所述细胞内。2.权利要求1的方法，其中所述方法提供至少约20％的基因组编辑效率。3.权利要求1的方法，其中所述细胞不包含编码所述Cas9的核酸和/或编码导向RNA的DNA核酸。4.权利要求1的方法，其中在a)的提供之前，所述细胞未被永生化或转化。5.权利要求4的方法，其中在b)的引入之后，所述细胞未被永生化或转化。6.权利要求1的方法，其中在a)的提供之前，所述细胞没有经过传代。7.权利要求6的方法，其中在a)的提供之前，所述细胞直接分离自宿主生物体或组织并被培养。8.权利要求6的方法，其中在a)的提供之前，所述细胞直接分离自宿主生物体或组织并且没有经过培养。9.权利要求1的方法，其中所述引入包括电穿孔。10.权利要求1的方法，其中所述引入包括：用所述Cas9核糖核蛋白复合物包被纳米线或纳米管；使所述细胞与包被有所述Cas9核糖核蛋白复合物的纳米线或纳米管接触；并且用包被有所述Cas9核糖核蛋白复合物的纳米线或纳米管刺穿所述细胞的细胞膜。11.权利要求1的方法，其中所述引入包括：迫使所述反应混合物通过比所述细胞的直径小的细胞变形压缩物，其中所述迫使向所述细胞的细胞膜中引入瞬时的孔；并且允许所述Cas9核糖核蛋白复合物通过所述瞬时的孔进入所述细胞。12.权利要求1的方法，其中所述Cas9核糖核蛋白复合物包含针对所述细胞上的细胞外受体的配体，并且所述引入包括所述Cas9核糖核蛋白复合物的受体介导的内化。13.权利要求1的方法，其中所述Cas9核糖核蛋白复合物包含细胞穿透肽，并且所述引入包括使所述细胞穿透肽与所述细胞接触。14.权利要求9的方法，其中所述电穿孔包括将所述反应混合物放置在阴极和阳极之间的室中，并且在所述阴极和所述阳极之间施加约20kV/m至约100kV/m的电压电位。15.权利要求14的方法，其中所述电压电位作为长度为约5ms至约100ms的脉冲被施加。16.权利要求15的方法，其中所述方法还包括重复施加电压电位脉冲2-10次。17.权利要求14的方法，其中：所述室是具有纵向长度和水平横截面积的中空室；所述室包括由所述纵向长度隔开的第一和第二远端末端；并且所述室具有：在第一远端末端的第一电极；和与所述室的第二远端末端流体连通的包含电解液的储蓄池，所述储蓄池具有第二电极。18.权利要求17的方法，其中所述室的纵向长度与水平横截面积之比为50至10,000。19.权利要求1的方法，其中所述反应混合物中的所述Cas9核糖核蛋白复合物的浓度为约0.25μM至约5μM。20.权利要求1的方法，其中所述反应混合物中的所述Cas9核糖核蛋白复合物的浓度为约0.9μM至约1.8μM。21.权利要求1的方法，其中所述反应混合物包含约1x105至约4x105个原代造血细胞或原代造血干细胞。22.权利要求1的方法，其中所述反应混合物包含约2x105至约2.5x105个原代造血细胞或原代造血干细胞。23.权利要求1的方法，其中所述细胞是原代造血细胞。24.权利要求23的方法，其中所述原代造血细胞是免疫细胞。25.权利要求24的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。26.权利要求25的方法，其中所述T细胞是调节T细胞、效应T细胞或幼稚T细胞。27.权利要求26的方法，其中所述调节T细胞、效应T细胞或幼稚T细胞是CD4+T细胞。28.权利要求25的方法，其中所述T细胞是CD4+CD25hiCD127lo调节T细胞。29.权利要求25的方法，其中所述T细胞是FOXP3+T细胞。30.权利要求25的方法，其中所述T细胞是CD4+CD25loCD127hi效应T细胞。...

【专利技术属性】
技术研发人员：亚历山大·马尔森，詹尼弗·道纳，杰弗里·布鲁斯通，凯瑟琳·舒曼，史蒂文·凌，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US