一种山羊miR‑27a定点修饰系统及其应用技术方案

本发明专利技术属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种山羊miR‑27a定点修饰系统及其应用。本发明专利技术构建山羊miR‑27a定点修饰的体系能够有效识别和修饰山羊miR‑27a启动子区中转录因子CP2的结合位点。本发明专利技术所述的miR‑27a启动子结合位点如序列表SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。本发明专利技术对山羊miR‑27a启动子区序列中的转录因子CP2集合位点进行分析，构建该结合位点的野生型双荧光素酶报告载体pGL3‑W，然后对集合位点进行碱基突变修饰，构建得到突变型双荧光素酶报告载体pGL3‑M。本发明专利技术所构建的两种双荧光素酶报告载体可用于研究山羊卵泡发育调控机制，对培育高产羔数山羊品种具有重要意义。

A goat miR 27a fixed-point modification system and its application

The invention belongs to the technical field of animal genetic engineering, in particular to a goat miR 27a fixed-point modification system and its application. The invention constructs 27a modified goat miR point system can effectively identify and modify the miR goat 27a promoter transcription factor binding sites in the promoter region of CP2. The miR 27a promoter binding sites such as SEQ ID NO:1 sequence list nucleotide sequences shown. The present invention relates to a transcription factor CP2 promoter sequence of the goat miR 27a collection sites are analyzed, combined with the construction of the wild type site of dual luciferase reporter vector pGL3 W, then the set of mutation loci were modified to construct the mutant luciferase reporter vector pGL3 M. The two dual luciferase reporter vectors constructed in this study can be used to study the regulation mechanism of goat follicular development, which is of great significance for the cultivation of goat breeds with high prolificacy.

【技术实现步骤摘要】
一种山羊miR-27a定点修饰系统及其应用
本专利技术属于动物基因工程
，具体涉及一种山羊miR-27a定点修饰系统及其应用特别是涉及到对某些特定功能转录因子与目的基因启动子结合位点序列的编辑工作，例如在本专利技术中阐述的将miR-27a启动子区中转录因子CP2的结合位点进行修饰，从而改变CP2与miR-27a启动子的结合能力。
技术介绍
MicroRNA(miRNA)是由内源性基因编码的单链非编码RNA，长度一般为16-29核苷酸(nucleotide,nt)左右，通过与靶基因mRNA的3’UTR互补配对来调控其转录后的表达水平(Gu,2009.GuS,JinL,ZhangF,SarnowP,KayMA.BiologicalbasisforrestrictionofmicroRNAtargetstothe3'untranslatedregioninmammalianmRNAs.NatStructMolBiol.2009Feb；16(2):144-50)。作为一种小分子序列，miRNA可以全局调控基因的表达，功能涉及到组织生长、细胞凋亡、脂肪代谢、卵细胞发育、精子发生等重要生命本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种山羊miR‑27a定点修饰系统,其特征在于：由山羊miR‑27a的双荧光素酶报告基因载体pGL3‑W和突变修饰后获得的载体pGL3‑M构成，所述的pGL3‑W载体包含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，pGL3‑M载体包含有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列，两段序列均位于山羊miR‑27a的5’UTR，通过如下步骤制备得到：(1)以登录号为NC_030814的山羊miR‑27a前体序列，利用NCBI数据库检索工具往前延伸1000bp为扩增模板，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；利用上述扩增模板，通过Touch‑down PCR方法克隆获得miR‑27a前体5’UTR片段...

【技术特征摘要】
1.一种山羊miR-27a定点修饰系统,其特征在于：由山羊miR-27a的双荧光素酶报告基因载体pGL3-W和突变修饰后获得的载体pGL3-M构成，所述的pGL3-W载体包含有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列，pGL3-M载体包含有SEQIDNO：9所示的核苷酸序列，两段序列均位于山羊miR-27a的5’UTR，通过如下步骤制备得到：(1)以登录号为NC_030814的山羊miR-27a前体序列，利用NCBI数据库检索工具往前延伸1000bp为扩增模板，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；利用上述扩增模板，通过Touch-downPCR方法克隆获得miR-27a前体5’UTR片段，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；(2)利用JASPAR数据库，预测得到山羊miR-27a的5’UTR启动子区中包含转录因子CP2的结合位点，其序列为GCTGCTGCCACACCCAGGG；(3)将步骤(1)扩增得到的序列插入双荧光素酶报告基因载体pGL3中，通过酶切、连接、转化感受态细胞、筛选阳性克隆并测序验证和抽提重组质粒，获得野生型双荧光素酶报告基因载体pGL3-W，其序列如SEQIDNO：2所示；(4)将步骤(3)构建的pGL3-W载体，针对需要修饰的转录因子CP2结合位点，设计如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示序列的突变引物，利用SEQIDNO：3和SEQIDNO：6所示序列的引物对PCR扩增出如SEQIDNO：7所示序列的目的片段；利用SEQIDNO：5和SEQIDNO：4所示序列的引物对PCR扩增出如SEQIDNO：8所示序列的目的片段；将SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示的序列通过融合PCR进行连接；以连接后产物为模板，以SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示序列为引物对，得到PCR扩增产物，其序列如SEQIDNO：9所示，通过酶切、连接、转化感受态细胞、筛选阳性克隆并测序验证、抽提重组质粒，得到转录因子CP2的结合位点突变型载体pGL3-M；融合PCR的扩增条件为：95℃5min；95℃30s，30℃30s，35℃5s，40℃5s，45℃5s，50℃5，、55℃5s，60℃5s，65℃5s，72℃30s，共计30个循环；72℃10min；于4℃保存。2.一种扩增山羊miR-27a的5’UTR区的Touch-downPCR引物对，其特征在于：所述引物对的序列如下所示：上游引物：CTAGCTAGCAGTGGTTTCCTCCTGCCCTTCA，下游引物：CCCAAGCTCCCTTGCCGCCATCCTTTG-3。3.一种对山羊miR-27a启动子区中...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶虎，陈明新，熊琪，李晓锋，索效军，张年，杨前平，刘洋，田宏，张鹤山，熊军波，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42