克隆限制修饰系统的方法技术方案

所提供的两步克隆限制修饰系统的方法包括在宿主中引入修饰基因或甲基化酶基因并表达，为保护宿主细胞使引入的限制基因或核酸内切酶基因表达能力低于被引入的修饰基因。同时提供了与生产限制酶有关的方法及ＢａｍＩ和ＤｄｅＩ限制基因的克隆。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术是有关，由此产生的克隆，和用克隆生产限制酶和(或)修饰酶的方法。具体讲是有关DdeⅠ和BamHⅠ限制性核酸内切酶和修饰性甲基化酶的克隆以及这些克隆和酶的生产方法。限制性核酸内切酶是天然存在于细菌中的一类酶，细菌中含有此酶的成分经分离提纯可在实验室中用于裂解DNA分子成为DNA片断。此类酶的这种性质便于DNA分子的鉴定和基因成分的分部分离。已经证明限制性内切酶是现代遗传学研究所不可缺少的工具，在遗传工程和遗传分析中被誉为生物化学的“剪刀”。限制性核酸内切酶能够识别DNA分子并结合在专一的核苷酸序列(“识别序列”)上。限制性核酸内切酶一旦与DNA结合上，就能在专一序列的内部或端部进行切割。不同的限制性核酸内切酶对不同的识别序列亲和性也不同。目前从数百种细菌中已鉴定出有将近一百种不同的限制性核酸内切酶。在每一种细菌中往往只含有极少量的限制性核酸内切酶。这类酶多根据来源菌的名称命名。比如埃及噬血菌(Haemophilus aeqyptius)所合成的三种不同的限制性核酸内切酶分别命名为HaeⅠ，HaeⅡ和HaeⅢ。这三种酶的识别序列及切点分别为(AT)GGCC(AT)，Pu GCGCPy和GGCC。再例如大肠杆菌RY(Escherichia coli RY13)只合成一种限制性核酸内切酶，定名为EcoRⅠ，其识别序列为GAATTC。事实上，限制性核酸内切酶对细菌细胞的生长具有保护作用，它可使细菌抵御外源DNA分子的入侵，如病毒和质粒DNA，这种外源DNA可破坏或寄生于细菌细胞。限制性核酸内切酶可沿外源DNA分子扫描，每发现一个识别序列就进行切割，从而使细菌对外源DNA具有抗性。切断了的外源DNA不能成为入侵基团并且对非专一性核酸内切酶的进一步降解作用更加敏感。细菌保护系统的另一成分是修饰性甲基化酶。这类酶与限制性核酸内切酶在功能上互补能够识别和区分内外源DNA。修饰性甲基化酶在DNA上的识别及结合序列与相应的限制性核酸内切酶相同，但不打断DNA。此酶只在识别序列内某一个或另一个核苷酸残基上进行化学修饰即加上一个甲基基团。甲基化后的识别序列不再被限制性核酸内切酶结合或切断。细菌细胞的DNA在甲基化酶的作用下充分甲基化，因而细菌DNA对内源性限制性核酸内切酶的存在丝毫不敏感，只有未被甲基化的，外源性的DNA才易被限制性核酸内切酶所识别和攻击。随着遗传工程技术的发展，目前有可能用克隆基因的方法来生产蛋白质和酶，比起常规提纯的方法其基因的编码量要大得多。分离限制性核酸内切酶克隆的关键是找到一种简单可靠的方法在复杂的“库”中鉴别出这种克隆。即在克隆频率为10-4到10-3用“鸟枪法”诱导克隆的程序。较优选的方法是能使大量不需要的克隆被破坏掉，而少量理想中的克隆被保留下来。Ⅱ型限制修饰系统越来越快地被克隆。首先克隆的系统是用细菌噬菌体感染作为选择性分离限制性核酸内切酶克隆手段(Pst I Walder et al.，Proc.Nat.Acad.Sci，74 1503-1507(1981)，Hha I IMann et al.Gene 397-112(1981))。由于限制修饰系统的存在使得细菌能够抵御细菌噬菌体的感染。被噬菌体感染的存活细胞原则上能选择性地分离出携带限制修饰系统基因克隆细胞。这种方法已经建立但有很大的局限性，特别是用这种方法克隆的限制修饰基因不能持久地为经选择存活下来的细胞提供极显著的噬菌体抗性。另一种克隆方法是转移系统本身具有负载质粒进入E.coli后形成克隆质粒的特性(Eco RV Bougueleret et al.，Nucl.Acid.Res.1293659-3676 1984;PacR7，Gingeras and Brooks.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80402-406 1983，Theriault and Roy，1982;RvuⅡ，Blumenthal et al;J，Bacteriol，164501-509 1985.)。最终为了选择一个具有活性的甲基化酶基因，目前正在克隆着若干个系统(Bsu RI，Kiss et al.，Nucl.Acid.Res.136403-6421 1986;Taq I);由于这两个基因经常是紧密连锁，所以两个基因可同时被克隆。然而筛选的甲基化酶常不能带有完整的限制性系统(Bsp RI，Szomolanyi et al.，Gene 10219-225 1980;MspI，Walder et al.J，Biol.Chem.2581235-1241 1983)。尽管试图克隆与甲基化酶基因相邻的较大区段也未能产生出具有活性的核酸内切酶基因。在某些系统中克隆的难点在于导入宿主的核酸内切酶基因不能靠被甲基化加以适当的保护。如果甲基化酶基因和核酸内切酶基因被引入一个普通DNA片段，则甲基化酶基因产物势必会在核酸内切酶基因产物裂解宿主基因组之前将宿主DNA加以修饰。在Ecoli中克隆限制修饰酶系统的另一障碍是在克隆分支甲基化酶的过程中发现的。许多Ecoli菌株(包括通常用于克隆的菌株)具有阻止带有甲基化胞苷的异源DNA导入宿主细胞的系统。(Raleigh and Wilson，submitted for publication)。因此有必要仔细考虑哪一种Ecoli菌株适于克隆。因为提纯的限制性核酸内切酶和少量的修饰性甲基化酶对于在实验室中描述DNA性质及DNA重排仍是很有用的工具，所以找到一种能使菌株合成大量酶的方法则更具有商业性的刺激作用。由于这种菌株能简化提纯过程并同时能提供商业性产量，因而这种菌株将是非常有用的。按照本专利技术，一种包括将修饰基因导入克隆载体并在适当的宿主细胞中表达以及将限制基因导入含有修饰基因的宿主细胞。本专利技术提供了一种生产限制性酶和(或)与之相应的修饰酶的方法，该方法是通过克隆编码上述二类酶的基因并在高水平上排列待表达的基因进行的。更明确地说是提供了一种克隆这些酶的新方法，这样生产的克隆以及生产这些酶本身的方法，首先是在合适的宿主内克隆和表达甲基化酶基因，目的在于靠甲基化来适当保护宿主;第二步，将核酸内切酶内切基因克隆并转导到含有甲基化酶克隆的宿主中，载体上核酸内切酶基因的表达水平低于甲基化酶基因的表达水平。脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)和淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloiquefaciens)的DdeⅠ和BamHⅠ限制及修饰基因中该方法的应用，以及所产生的克隆将分别进行详细的描述，所产生的克隆构成纯化DdeⅠ和BamHⅠ限制及修饰酶的一套新的，极有用的克隆方法的基础。本专利技术将根据实施例加以说明，有关附图如下图1为带质粒的pDde 3.0a甲基化酶Tn5基因图及DdeⅠ甲基化酶高表达克隆pDdeM 1.6的组建。图2为体内M.DdeⅠ克隆保护性测定结果的说明。图3表明M.DdeⅠ是胞苷甲基化酶。图4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种克隆限制修饰系统的方法，该方法包括修饰基因引入克隆载体使其在适当的宿主细胞内表达，将限制基因引入到含修饰基因的宿主细胞内。

【技术特征摘要】
US 1986-6-6 8720461.一种克隆限制修饰系统的方法，该方法包括修饰基因引入克隆载体使其在适当的宿主细胞内表达，将限制基因引入到含修饰基因的宿主细胞内。2.根据权利要求1所述的方法，其中将修饰基因引入克隆载体并在适当宿主细胞中表达。具体步骤包括(a)从含有用作克隆的限制修饰系统的材料中提纯DNA，(b)至少部分消化提纯的DNA使其形成DNA片段，(c)连接DNA片段到克隆载体上，(d)用步骤(c)的克隆载体转化宿主细胞以建立库，(e)从库中筛选含有修饰基因的克隆，和(f)培养含有步骤(e)中克隆的宿主细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其中在筛选后和培养前将限制基因引入宿主细胞。4.根据权利要求2或3所述的方法，其中从含有限制修饰系统的细菌或病毒中选择DNA来源。5.根据上述任一权利要求所述的方法，其中克隆的载体是质粒或病毒DNA分子。6.根据权利要求5所述的方法，其中质粒为pBR322、pUC8、...

【专利技术属性】
技术研发人员：琼埃兰布鲁克斯，金伯利安哈瓦德，
申请(专利权)人：新英格兰生物实验室公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]