植物种的转化和外源基因的表达制造技术

本发明专利技术涉及通过将子叶的带叶分枝培养物与外源基因共培养转化，随后由转化细胞再生出植物体，从而产生能表达外源基因的植物体以产生植物种，特别是利用一种受到控制的农业土壤杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ－ｒｉｕｍ）转化系统来转化蕃茄带叶分枝培养物，而后使转化的蕃茄组织再生成植物体。该土壤杆菌质粒已于一九八六年三月廿日保藏在ＡＴＣＣ，保藏号为６７１１８。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种改良植物的基因型和表型的方法，该方法对植物子叶组织，特别是对用一种由植物饲养细胞制备的培养基预处理的子叶引入一种农业土壤杆菌(Agrobacterium)的转化系统。该方法能高效地用于转化植物以达到增强性能和/或提供新的表型。植物育种方法的应用一直受到限制是由于很难在植物种间进行基因转移，因此开发一种方法用于植物种的遗传工程可能是具有吸引力的，但是植物细胞与其他类型的细胞对转化系统的要求实质上是很不相同的。首先，植物细胞不同于单细胞微生物，它们的增殖率低;其次，对于生存、增殖和再生来说，植物细胞对它们所处的环境极为敏感;第三，为了确定外源基团是否已起作用地被整合在植物细胞内，需要证实再生植株是否已表达了基因产物;最后，使植物细胞具有硬质的细胞壁进行遗传工程将更加困难。由于在植物细胞操作和基因有效表达的证实之间有着相当长的时间间隔，因此，在转化、细胞生长及再生植株的每个阶段要求实现高效率是必不可少的。另外还应考虑到使特定技术和该技术中所利用的材料与特定植物种之间的相匹配问题。此外，为了从转化细胞的愈伤组织获得再生植株，还需进一步机虑转化培养物的连续手工操作。A.L.Gunay et al.Plant Science Letters(1978)11365-372，介绍了从红胡椒子叶离体再生胡椒;J.R.Liu et al.，Plant Cellorgan Culture(1983)2293-304，介绍了从包括子叶在内的苹果幼苗外植体的再生;B.R.Thomas et al.，Theor.Appl.Genet.(1981)59215-219，介绍了蕃茄再生培养基;The 1985 Calgene U.S.Patent Application Serial No.798，050 by Fillatti et al.介绍了本专利技术的农业土壤杆菌;in Horsch et al.Science(1985)2281229-1231介绍了用叶圆片法根癌农业土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciene)转化植物;也可参考Herrera-Estrella et al.，Nature(1983)303209-213;Fraley et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)804803-4807;and Bevan et al.，Nature(1983)304184-187，in Stalker et al.，J.Biol.Chem.(1985)2604724-4728，介绍了草甘膦抗性aro A基因;而由deGreve，J.Mol.Appl.Genet.(1983)1499-511;Salomon et al.，EMBO J.(1984)3141-146;Velten et al.，ibid.(1984)32723-2730;Garfinkel et al.，Cell(1983)27143-153;and Barker et al.，Plant Mol.Bio(1983)2335-350.介绍了转录起始区和终止区;Comai et al.，Nature(1985)317741-744，介绍了对草甘膦提供耐性的鼠伤寒沙门氏菌突变基因aro A在植物体中的表达;其它讨论蕃茄子叶再生的报导包括Orsay，French Theor.Appl.Genet.68(4)，1984，317-322;Seeni，S.et al.，Canadian J.Botany 59(10)，1981，1941-1943;and Vnuchkova，V.A.，Fiziol Rast(Moscow，USSR)，24(5)，1977，1094-1100。本专利技术提供的方法是产生转化的植物种，所得到的植物种含有能稳定表达的新核苷酸构建物。这些方法是采用改装的(disarmed)农业土壤杆菌和植物子叶组织的高效率转化技术。植物子叶组织正常情况是与由植物饲养细胞所限定的培养基预培育。这种方法可得到高比例的正常转化细胞，而后这些正常转化的细胞能再生成植株，这些植株能生长成植物并结实。该技术能为稳定表达的引入的基因提供保证，尤其是引入的外源基因使植物具备新的表型。本专利技术提供了包括用植物子叶组织将新的核苷酸构建物引入植物种的细胞的新方法和新产品。这些被转化的细胞的再生形成表达存在于该核苷酸构建物中的一种或多种基因的植物体，从而至少提供一种不同于原来栽培品种的植物的性状，尤其是表型性状。所用的方法是利用受伤的子叶组织与限定的培养基一起预培育，所预培育的植物子叶组织与经过改装并被转化的农业土壤杆菌在适当的营养培养基中共培养，这种农业土壤杆菌具有转化植物细胞的能力，并且有一种DNA的构建物连结在T-DNA的一个边界上。这种构建物的制备是通过连结异源的DNA片段，其中包括至少能在寄主体内转录的一个基因。当构建物中有一种选择标记物时，共培养的细胞可转移到再生培养基中，该再生培养基通常含有为转化细胞而选用的杀菌剂。带叶分枝形成后，将分枝转移到选择的生根培养基中形成完整的小植株，而后小植株可能会长大以提供种子，插条等等，以便繁殖新的植物。所以，该方法能保证高效率转化植物细胞及由这些转化细胞再生出植物体。可被转化的植物种都是那些大批生产有待于培养和经营的植物，这些植物包括蔬菜、水果、观赏花、木本植物种等等，如下述的双子叶植物和多子叶植物蕃茄、松属、胡椒、莴苣、黄瓜、大豆、芸苔属(油菜子)、杨树、观尝花等等。用灭菌的种子作植物子叶的来源，这些子叶可以是成熟的或不成熟的、可以是已经从种子内伸出的或还存在于种子内的、也可切开种子并从种皮内解剖出子叶。许多植物的子叶会是已经伸出来的，但有少数几种，如松树，其子叶可能是未成熟的，而要从种子内获得。为了得到伸出的子叶，通常要在合适的萌发培养基中，萌发至少4天，但要少于约15天，最好为6到8天。所得到的子叶组织用作转化织织的来源，子叶受到损伤作为再生部位，再生发生在靠近基部的受伤细胞部位是较好的。最方便的是将子叶切成几片，通常切成三片，而利用中间的那片。将受伤的子叶组织转移到饲养平板上，饲养平板上的细胞对受伤的子叶组织作为一种滋养培养物并提高转化效率。任何适合的植物细胞悬浮液均可作饲养培养物，如烟草(Nieotiana)或玉米，尤其是前者。然而烟草饲养细胞对于某些作物，例如蕃茄是最佳的，玉米即其他的植物饲养细胞作为饲养细胞也有用。与饲养细胞所限定的培养基的预培育的时间通常至少6小时，但不得超过约48小时，通常是用12到24小时。制备饲养平板是通过用植物悬浮液培养物，如烟草细胞约104-1010细胞/毫升，通常107-108细胞/毫升，置于软的琼脂培养基内，一般为含有约0.5%至1%琼脂和适宜的生长培养基，如Murashige和Skoog基本有机培养基、适量本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效转化植物细胞的方法，将ＤＮＡ引入上述的植物细胞，该ＤＮＡ能在上述细胞中复制和转录，该方法包括：在植物细胞所限定的培养基中培育子叶细胞，并与含有一种构建体、并被改装和转化的农业土壤杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）细胞共培养。这种 构建体包括一个Ｔ－ＤＮＡ的边界和能够在植物细胞内转录的一个有价值的基因，此构建体还能够被转移至植物细胞内，以后整合进入该植物细胞的基因组。利用上述构建体能够被整合进入该植物细胞基因组，以便提供被转化的植物细胞。除去上述转化植物细胞的细菌 ，在再生培养基中培育该转化的植物细胞，以产生带叶的分枝，以及转移带叶分枝到生根培养基中以产生小植物。

【技术特征摘要】
US 1986-6-10 872,5321.一种高效转化植物细胞的方法，将DNA引入上述的植物细胞，该DNA能在上述细胞中复制和转录，该方法包括在植物细胞所限定的培养基中培育子叶细胞，并与含有一种构建体、并被改装和转化的农业土壤杆菌(Agrobacterium)细胞共培养。这种构建体包括一个T-DNA的边界和能够在植物细胞内转录的一个有价值的基因，此构建体还能够被转移至植物细胞内，以后整合进入该植物细胞的基因组。利用上述构建体能够被整合进入该植物细胞基因组，以便提供被转化的植物细胞。除去上述转化植物细胞的细菌，在再生培养基中培育该转化的植物细胞，以产生带叶的分枝，以及转移带叶分枝到生根培养基中以产生小植物。2.根据权利要求1的方法，其中上述子叶细胞是通过完全无菌的条件下，得到萌发的无菌种子，形成伸出的子叶;以及将上述子叶至少切成两片，除去该种子的其他部分并挑选更靠近种子的那片子叶切片。3.根据权利要求1的一种方法，其中所说的限定培养基是指含有激素和维生素的软的琼脂培养基中，有每毫升104-1010细胞生长，这种培养基在培育上述子叶细胞时，至少前一天制备出来。4.根据权利要求1的一种方法，其中所说的植物细胞首先与细菌肉汤液体培养基中的上述土壤杆菌接触，随后将与土壤杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔安菲拉蒂，布鲁斯R托马斯，
申请(专利权)人：加利福尼亚基因公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]