一种用于多种克隆策略并具有表达功能的质粒载体及其构建方法技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体的说是一种具有广泛的应用的适用于多种克隆策略并具有表达功能的质粒载体及其构建方法。载体为闭合环状双链DNA，含有两个能够识别多种克隆策略的多克隆位点区，两个多克隆位点区之间为毒性蛋白标记ccdB 基因。本发明专利技术质粒载体在分子克隆、蛋白表达和纯化方面的功能得到了验证。本发明专利技术质粒载体既可以应用各种不同的克隆要求，而且可方便高效地进行蛋白表达和纯化，而不需要亚克隆步骤，因此本发明专利技术质粒载体因其更方便、高效，将在基因工程领域发挥重要的作用。

A plasmid vector for multiple cloning strategies with expressive function and its construction method

The invention relates to the field of gene engineering, in particular, a plasmid vector with wide application and suitable for a plurality of cloning strategies and has the expressive function, and the construction method thereof. Carrier is a closed circular double stranded DNA, containing two to multiple cloning sites to identify the cloning strategy, toxic protein marker ccdB between two multiple cloning sites of gene. The function of the plasmid vector in molecular cloning, protein expression and purification has been verified. The invention can clone plasmid application requirements of different kinds of convenient and efficient protein expression and purification, without subcloning steps, so the invention of plasmid vector because of its more convenient and efficient, will play an important role in the field of genetic engineering.

【技术实现步骤摘要】
一种用于多种克隆策略并具有表达功能的质粒载体及其构建方法
本专利技术涉及基因工程领域，具体的说是一种具有广泛的应用的适用于多种克隆策略并具有表达功能的质粒载体及其构建方法。
技术介绍
基因克隆是分子生物学的核心技术，是研究基因结构和功能的基础。克隆方法可分为两类：连接酶依赖性克隆和连接酶非依赖性克隆。其中，连接酶依赖性克隆方法主要有三种，包括：粘性末端连接、平末端连接和TA克隆。近些年，各种连接酶非依赖性克隆方法也得到快速发展，比如：Gateway、LIC、USER、SLIC、PIPE、CPEC、OEC、FastCloning、SLiCE和重组酶克隆等技术（YaoS,HartDJ,AnY.RecentadvancesinuniversalTAcloningmethodsforuseinfunctionstudies.ProteinEngDesSel.2016;1-6.）。尽管连接酶非依赖性克隆方法有很多成功的应用实例，但是仍然不能完全替代连接酶依赖性克隆方法成为主要的克隆策略。连接酶依赖性克隆中效率最高的是粘性末端连接，该方法也是目前使用最为广泛的分子克隆策略。但在某些情况下，该方法无法获取合适的限制性酶切位点，而这无疑增加了克隆的难度。相对而言，平末端产物比较容易获得（比如通过酶切或者PCR获得），两条具有平末端的DNA序列可以通过连接酶连接起来。平末端连接也是一种有效的连接方式，但是其连接效率比粘性末端连接要低。TA克隆技术（TAcloning）利用Taq聚合酶的末端转移酶活性，可在PCR产物的3'端加上一个非模板依赖碱基“A”。而TA克隆载体（即T载体）的3'端有一个凸出的“T”，可以与上述PCR产物的3'-“A”互补配对，实现TA克隆。TA克隆是目前克隆PCR产物最简便、快捷的方法之一。该方法不需要合适的酶切位点，可用于克隆未知序列的DNA片段，并且具有令人满意的克隆效率。目前，用于TA克隆的载体（也就是T载体）的制备方法常见的有两种。第一种方法是利用Taq酶不依赖模板的末端转移酶活性，将单个脱氧胸腺核苷酸（dTTP）添加到线状载体3'端（MarchukD,DrummM,SaulinoA,CollinsFS.ConstructionofT-vectors,arapidandgeneralsystemfordirectcloningofunmodifiedPCRproducts.NucleicAcidsRes.1991;19(5):1154.）。第二种方法是在质粒载体的多克隆位点中引入特定的酶切位点，用相应的内切酶酶切产生3'端具有单个T突出的线性T载体。前一种方法在制备T载体时，会出现加尾效率较低和加尾过程中线性质粒两端的序列有时会被部分删除等问题（ShumanS.NovelapproachtomolecularcloningandpolynucleotidesynthesisusingvacciniaDNAtopoisomerase.JBiolChem.1994Dec23;269(51):32678-32684.）。与第一种方法相比，第二种方法更高效、更快捷并且更稳定。在连接酶非依赖性克隆策略中，基于重组酶的克隆方法是最近兴起的，也是目前应用最为广泛的一种方法之一。采用该方法，插入片段和载体的分子末端仅需要15-20bp的重叠区，即可在重组酶的作用下发生体外同源重组，然后转化进大肠杆菌中实现分子克隆。因此，采用重组酶克隆不需要寻找合适的限制性内切酶位点，不需要连接酶的作用，就可以实现高效的定向克隆。目前，市场上已经有很多商业化试剂盒可用于基于重组酶的分子克隆。尽管上述克隆方法都有很多成功的例子，但是无论使用哪种方法，在载体制备和克隆过程中都存在潜在的问题：1）现有的载体一般只适用于一种或者少数几种克隆策略，使得在克隆方法的选择上缺乏灵活性。2）在现有的克隆方法中，在载体的制备过程中，部分酶切的前载体混杂在载体中，会导致非重组转化子的本底过高（HarrisonJ,MolloyPL,ClarkSJ.DirectcloningofpolymerasechainreactionproductsinanXcmIT-vector.AnalBiochem.1994;216(1):235-236.）。而在制备载体的过程中，虽然可以通过电泳和胶回收的方法帮助去除这些前载体污染，但是效果往往不够理想，并且显著增加了工作量。3）很多载体只适用于克隆，而实现插入基因的表达和纯化则需要亚克隆到表达载体上，这无疑增加了工作量。4）目前绝大多数克隆载体的大小都在3kb甚至5kb以上。通常情况下，大片段的克隆效率较低。综上所述，现急需一种具有广泛的应用前景、适用于多种克隆策略并具有表达功能的质粒载体及其构建方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有广泛的应用前景、适用于多种克隆策略并具有表达功能的质粒载体及其构建方法。为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为：一种用于多种克隆策略并具有表达功能的质粒载体，载体包括启动子和终止子，载体为闭合环状双链DNA，含有两个能够识别多种克隆策略的多克隆位点区，两个多克隆位点区之间为毒性蛋白标记ccdB基因；其中，所述多克隆位点区之一（MCS-1）中的位点为BamHI、SpeI、StuI、SalI和AhdI位点；另一多克隆位点区（MCS-2）中位点为SalI、AhdI、StuI、NcoI、SacI和PstI位点。所述载体还包括抗性基因序列、pMB1复制子和His-tag编码序列。所述启动子为T7启动子，终止子为T7终止子。所述载体为SEQIDNo:1中所示的碱基序列；载体中所示的DNA功能区：特殊设计的多克隆位点区的StuI位点用于制备平末端载体，进行平末端克隆；AhdI位点用于制备T载体，进行TA克隆；BamHI、SpeI、SalI、NcoI、SacI和PstI位点用于制备粘性末端载体，进行粘性末端克隆；所有多克隆位点区的位点都可以用于制备线性片段，进行重组酶克隆；T7promoter和T7terminator使该质粒具有蛋白表达功能；His-tag区使得表达后的蛋白能被镍柱纯化，而TEV位点则可以将纯化蛋白中的组氨酸尾巴从蛋白中切掉；ccdB基因序列编码毒性蛋白，作为克隆过程的负筛选标记，确保克隆没有假阳性。一种用于多种克隆策略并具有表达功能的质粒载体的构建方法，1）以质粒pYUM6002为模板，BamHI-T-For和PstI-T-Rev为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物待用；BamHI-T-For：5’-TCGCGGATCCCCCCTGAAAATACAAATTCTCGGTAGTTGG-3’和PstI-T-Rev：5’-TCATCTGCAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAAC-3’；2）以质粒PhisKan5为模板，CcdB-For和CcdB-Rev为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物待用；CcdB-For:5’-CGCGGATCCACTAGTAGGCCTGTCGACGGTCAGTCCGGCTTACTAAAAGCCAGATAACAGTATGCG-3’和CcdB-Rev:5’-CATCTGCAGGAGCTCCCATGGAGGCCTGACGGTCAGTC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于多种克隆策略并具有表达功能的质粒载体，载体包括启动子和终止子，其特征在于：载体为闭合环状双链DNA，含有两个能够识别多种克隆策略的多克隆位点区，两个多克隆位点区之间为毒性蛋白标记ccdB 基因；其中，所述多克隆位点区之一（MC S‑1）中的位点为BamHI、SpeI、StuI、SalI和AhdI位点；另一多克隆位点区（MC S‑2）中位点为SalI、AhdI、StuI、NcoI、SacI和PstI 位点。

【技术特征摘要】
1.一种用于多种克隆策略并具有表达功能的质粒载体，载体包括启动子和终止子，其特征在于：载体为闭合环状双链DNA，含有两个能够识别多种克隆策略的多克隆位点区，两个多克隆位点区之间为毒性蛋白标记ccdB基因；其中，所述多克隆位点区之一（MCS-1）中的位点为BamHI、SpeI、StuI、SalI和AhdI位点；另一多克隆位点区（MCS-2）中位点为SalI、AhdI、StuI、NcoI、SacI和PstI位点。2.按权利要求1所述的用于多种克隆策略并具有表达功能的质粒载体，其特征在于：所述载体还包括抗性基因序列、pMB1复制子和His-tag编码序列。3.按权利要求1所述的用于多种克隆策略并具有表达功能的质粒载体，其特征在于：所述启动子为T7启动子，终止子为T7终止子。4.按权利要求1-3所述的用于多种克隆策略并具有表达功能的质粒载体，其特征在于：所述载体为SEQIDNo:1中所示的碱基序列。5.一种权利要求1所述的用于多种克隆策略并具有表达功能的质粒载体的构建方法，其特征在于：1）以质粒pYUM6002为模板，BamHI-T-For和PstI-T-Rev为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物待用；BamHI-T-For：5’-TCGCGGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：安迎锋，刘霞，高嵩，高和瑞，张艺锋，许淑敏，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21