一种多基因组装载体系统及其多基因组装方法技术方案

本发明专利技术公开了一种多基因组装载体系统及其多基因组装方法。该系统包括1类接受载体、2类供给载体、以及可选择使用的能发生筛选标记自删除的供给质粒。该系统利用Cre/loxP重组系统和两组突变型loxP的不可逆重组位点，在Cre酶作用下，以野生型loxP位点的重组来实现供给载体整合到接受载体中，然后其一组突变型loxP的不可逆重组自动删除供给载体的骨架，只留下目的基因在接受载体上；重复2类供给载体交替与接受载体的组装，就能实现多基因的快速组装。本发明专利技术是目前最简单高效的多基因载体系统。因此本发明专利技术对重要的、复杂生物合成途径和重要农艺性状的多基因遗传工程操作提供了可操作的技术平台，具有重要的应用价值。

Multi genome loader system and multi gene assembly method thereof

The invention discloses a multi genome loader system and a multi gene assembly method thereof. The system consists of 1 classes of acceptance vectors, 2 classes of delivery vectors, and selectable supply plasmids that can be screened, tagged, and self deleted. The system uses Cre/loxP recombination system and two groups of mutant loxP irreversible recombination sites in Cre, under the action of enzyme in wild type recombinant loxP sites to achieve supply vector integration to accept vector, then a group of mutant loxP irreversible recombinant vector supply automatically delete the skeleton, leaving only the target gene in accept carrier; repeat 2 class supply alternating with acceptable carrier carrier assembly, can achieve rapid assembly of multiple genes. The present invention is the most simple and efficient multi gene carrier system. Therefore, the present invention provides an operable technical platform for polygenic genetic engineering operations of important and complex biosynthetic pathways and important agronomic traits, and has important application value.

【技术实现步骤摘要】
一种多基因组装载体系统及其多基因组装方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种多基因组装载体系统及其多基因组装方法。
技术介绍
植物(作物)中重要的性状如很多农艺性状、复杂代谢合成途径、重要信号传导途径、重要功能的蛋白复合体等都涉及到了多个基因的共同作用，受多基因控制，其基因工程操作常常需要用到多基因转化叠加技术(TransGeneStacking,TGS)。而常规的转基因技术手段只能完成少数(通常1-3个)基因的操作。“黄金大米”和“紫番茄”是目前成功报道的多基因转化作物的两个成功案例，但它们也仅仅是用了2个基因。因此，多基因组装与转化技术是目前基因工程研究的热点与难点，具有重要的应用前景。与多质粒混合后基因枪共转或单基因分别转化后再杂交聚合的方法相比，在同一植物表达载体上组装多个基因再转化植物的方法是更直接、简单和高效的。但多基因表达载体的构建是其限制因素。传统的酶切连接方法，受到酶切位点的限制，很难完成多个基因在一个表达载体上的构建。为此，目前已有几种多基因组装的方法，包括基于稀有内切酶和归巢内切酶建立pRCS/pAUX和pSAT载体系统(Goderisetal.,2000本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多基因组装载体系统，其特征在于：命名为TGSII，包括1类接受载体、2类供给载体、以及可选择使用的能发生筛选标记自删除的供给质粒；2类供给载体分别命名为供给载体I和供给载体II；接受载体具有如SEQ ID NO.1所示的loxP/I‑Sce I/loxP1R核心元件DNA序列；供给载体I具有如SEQ ID NO.2所示的loxP/PI‑Sce I/loxP2R/MCS/loxP1L/I‑Sce I核心元件DNA序列：供给载体II具有如SEQ ID NO.3所示的loxP/I‑Sce I/loxP1R/MCS/loxP2L/PI‑Sce I核心元件DNA序列。

【技术特征摘要】
1.一种多基因组装载体系统，其特征在于：命名为TGSII，包括1类接受载体、2类供给载体、以及可选择使用的能发生筛选标记自删除的供给质粒；2类供给载体分别命名为供给载体I和供给载体II；接受载体具有如SEQIDNO.1所示的loxP/I-SceI/loxP1R核心元件DNA序列；供给载体I具有如SEQIDNO.2所示的loxP/PI-SceI/loxP2R/MCS/loxP1L/I-SceI核心元件DNA序列：供给载体II具有如SEQIDNO.3所示的loxP/I-SceI/loxP1R/MCS/loxP2L/PI-SceI核心元件DNA序列。2.根据权利要求1所述的多基因组装载体系统，其特征在于：所述的接受载体具有如下特点：(1)具有1个野生型的loxP特异重组位点，1个归巢酶I-SceI位点和1个突变loxP位点loxP1R，并按loxP/I-SceI/loxP1R的位置排列；(2)具有1个不同于供给载体的细菌抗生素选择标记基因；(3)具有1个DNA质粒的复制子元件；所述的供给载体I具有如下特点：1)具有1个野生型loxP位点和2个归巢酶位点PI-SceI和I-SceI；2)具有2个突变型loxP位点loxP2R和loxP1L；3)具有一个多克隆位点MCS；4)特征1)～3)中的位点按loxP/PI-SceI/loxP2R/MCSloxP1L/I-SceI的顺序排列；5)具有1个不同于接受载体与供给载体II的细菌选择标记基因；所述的供给载体II具有如下特征：①具有1个野生型特异重组位点loxP和2个归巢酶位点I-SceI和PI-SceI；②具有2个突变的loxP位点loxP1R和loxP2L；③具有一个多克隆位点MCS；④特征①～③中的位点按loxP/I-SceI/loxP1R/MCS/loxP2L/PI-SceI的顺序排列；⑤具有1个不同于接受载体与供给载体I的的细菌选择标记基因；所述的可选择使用的能发生筛选标记自删除的供给质粒具有如下特点：(A)具有Gateway特异重组反应的两个位点attP1和attP2；(B)具有2个同向的或1个野生型loxP位点；(C)具有任一个植物筛选标记基因；(D)具有诱导型启动子或器官特异表达启动子驱动的重组酶基因Cre的表达盒；(E)特征(A)～(D)中的位点和基因在质粒载体上的排列顺序为：attP1/loxP/植物筛选标记/Cre表达盒/loxP/attP2，构成可删除筛选标记结构。3.根据权利要求2所述的多基因组装载体系统，其特征在于：接受载体的特点(2)中所述的细菌抗生素选择标记基因为卡拉霉素抗性基因；接受载体的特点(3)中所述的DNA质粒的复制子元件为P1噬菌体的复制子；供给载体I的特点5)中所述的细菌选择标记基因为氯霉素抗性基因；供给载体II的特点⑤具中所述的细菌选择标记基因为氨苄抗性选择基因；能发生筛选标记自删除的供给质粒的特点(C)中所述的植物筛选标记基因为抗潮霉素基因、抗卡拉霉素或抗草甘膦基因。4.根据权利要求2所述的多基因组装载体系统，其特征在于：所述的接受载体为pYLTAC380GW、pYLTAC380、pYLTAC380H、pYLTAC380N、pYLTAC380B、pYL0380、pYL1300H；接受载体pYL0380通过如下步骤制备得到：将如SEQIDNO.4所示的序列，通过EcoRI和HindIII双酶切后，克隆到EcoRI和HindIII双酶切后的pCAMBIA0380得到；接受载体pYL1300H通过如下步骤制备得到：将如SEQIDNO.4所示的序列，通过EcoRI和HindIII双酶切后，克隆到EcoRI和HindIII双酶切后的pCAMBIA1300得到；接受载体pYLTAC380通过如下步骤制备得到：以pYLTAC747质粒为模板，用引物P1/P2进行PCR扩增，获得骨架片段；以pYL0380质粒为模板，用引物P3/P4进行PCR扩增，获得插入片段；用XbaI分别酶切骨架片段和插入片段，将酶切后的骨架片段和插入片段连接，得到接受载体pYLTAC380；接受载体pYLTAC380H通过如下步骤制备得到：以pCAMBIA1300为模板，用引物P5/P6进行扩增，得到两侧带有KpnI位点的抗潮霉素基因；用KpnI分别单酶切两侧带有KpnI位点的抗潮霉素基因和接受载体pYLTAC380；再将酶切后的抗潮霉素基因和接受载体pYLTAC380连接，得到pYLTAC380H载体；接受载体pYLTAC380N通过如下步骤制备得到：以pCAMBIA2300为模板，用引物P5/P6进行扩增，得到两侧带有KpnI位点的抗卡拉霉素基因；用KpnI分别单酶切两侧带有KpnI位点的抗卡拉霉素基因和接受载体pYLTAC380；再将酶切后的抗卡拉霉素基因和接受载体pYLTAC380连接，得到pYLTAC380N载体；pYLTAC380B载体通过如下步骤制备得到：以pCAMBIA3301为模板，用引物P5/P6进行扩增，得到两侧带有KpnI位点的抗草甘膦基因基因；用KpnI分别单酶切两侧带有KpnI位点的抗草甘膦基因和接受载体pYLTAC380；再将酶切后的抗草甘膦基因基因和接受载体pYLTAC380连接，得到pYLTAC380B载体；接受载体pYLTAC380GW通过如下步骤制备得到：通过KpnI和BamHI双酶切分别酶切如SEQIDNO.5所示的带有Gateway重组反应位点的KpnI/attP1/SacB/attP1/BamHI片段和接受载体pYLTAC380，再将酶切后的带有Gateway重组反应位点的KpnI/attP1/SacB/attP1/BamHI片段和接受载体pYLTAC380连接，得到接受载体pYLTAC380GW。5.根据权利要求2所述的多基因组装载体系统，其特征在于：所述的供给载体I为pYL322d1，其通过如下步骤制备得到：以pYL1300H为模板，通过引物P7/P8扩增，得到骨架片段；以pYLSV质粒为模板，通过引物P9/P10扩增，得到插入片段I；再通过BssHII和MluI双酶切分别酶切骨架片段和插入片段I，得到中间载体d1-I；通过BssHII分别单酶切中间载体d1-I和如SEQIDNO.6所示的插入片段II，将单酶切后的中间载体d1-I和插入片段II连接，得到中间载体d1-II；通过EcoRV分别单酶切中间载体d1-II和如SEQIDNO.7所示的插入片段III，将单酶切后的中间载体d1-I和插入片段III连接，得到质粒pYL322d1；所述的供给载体II为pYL322d2，其通过如下步骤制备得到：以pYL322d1为模板，通过引物P11/P12扩增，得到骨架片段；以pUC18质...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘耀光，祝钦泷，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44