通过降低rnpA基因表达制备重组蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及一种改进重组微生物中难表达重组蛋白产量的方法，且更具体地涉及一种通过使用重组微生物改进难表达重组蛋白产量的方法，所述重组微生物中导入编码靶蛋白的基因与针对编码核糖核酸酶P的基因的sRNA。根据本发明专利技术，大重组蛋白、难表达蛋白和有用蛋白的表达可通过降低rnpA基因的表达而显著增加。

Method for preparing recombinant protein by reducing expression of rnpA gene

The invention relates to an improved method for expression of recombinant microorganism to recombinant protein production, and more specifically relates to a recombinant microorganism by using the improved method difficult to express recombinant protein production, gene encoding the target protein of the recombinant microorganism in gene and encoding for ribonucleic acid enzyme P sRNA. In accordance with the present invention, the expression of large recombinant proteins, poorly expressed proteins and useful proteins can be significantly increased by reducing the expression of the rnpA gene.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种改进重组微生物中重组蛋白产量的方法，且更具体地涉及一种通过使用重组微生物改进重组蛋白产量的方法，所述重组微生物中导入编码靶蛋白的基因和针对编码核糖核酸酶P的基因的sRNA。
技术介绍
基因操作技术的发展已经使得许多研究集中于使用细菌和多种动植物制备大量有用蛋白。现有用于制备大量有用蛋白的宿主细胞，包括诸如大肠杆菌(E.coli)的细菌，和诸如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)的酵母菌。在这些宿主细胞中，大肠杆菌使用最为广泛，对其进行的研究最为多(Choi等，Chem.Eng.Sci.,66:876,2006；Lee,TrendsBiotechnol.,14:98,1996)。然而，如果待制备的有用蛋白大小比天然存在的蛋白质大或难以表达，则会出现许多问题。如果一种蛋白质的大小较大，由于缺乏信使RNA(mRNA)，该蛋白质的翻译困难，由此所需长度的蛋白质的表达困难。另外，由于蛋白水解和RNA酶诱导的mRNA降解，非天然存在于大肠杆菌中的重组蛋白难以表达(GoBringer等，JBacteriol.,188:6816,2006；Olson等，PLoSPathog.,7(2):e1001287,2011；Jung等，BiochemBiophysResCommun.,186(3):1463,1992；Altman等，PhilTransRSoc.,366,2011；Turrini等，PLosOne.,7(3):e32456,2012)。因此，本专利技术的专利技术人已经进行了广泛的努力来开发增加难表达外源蛋白产量的蛋白表达系统，结果是，发现在通过导入编码外源蛋白的基因表达外源蛋白过程中降低rnpA基因(是核糖核酸酶P的组分)的表达，难表达外源蛋白的表达增加，从而实现了本专利技术。
技术实现思路
技术问题本专利技术的一个主要目的是提供一种重组微生物，所述重组微生物中导入编码靶蛋白的基因和针对编码核糖核酸酶P的基因的sRNA以增加难表达外源蛋白的产量。本专利技术的另一个目的是提供一种通过培养上述重组微生物制备靶蛋白的方法。技术方案为了实现上述目的，本专利技术提供一种用于表达靶蛋白的重组载体和一种重组微生物，所述重组载体包含编码靶蛋白的基因和针对编码核糖核酸酶P的基因的sRNA，所述重组微生物中导入所述重组载体。本专利技术还提供了一种重组微生物，所述重组微生物中导入编码靶蛋白的基因和针对编码核糖核酸酶P的基因的sRNA。本专利技术还提供了一种用于制备靶蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：(a)通过培养上述重组微生物和诱导所述重组微生物中靶蛋白表达而制备所述靶蛋白；(b)回收所制备的靶蛋白。本专利技术还提供一种用于制备靶蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：通过培养其中导入编码所述靶蛋白的基因的重组微生物来表达和制备所述靶蛋白；回收所制备的靶蛋白，其中，降低核糖核酸酶P的表达以增加所述靶蛋白的表达。附图说明图1是质粒pTetly2glyAN-rnpA(sRNA)的基因图谱。图2显示了通过SDS-PAGE分析由16个重复序列组成的丝蛋白和由32个重复序列组成的丝蛋白的表达水平的结果。(泳道1：显示蛋白质标准分子量的标记物；泳道2和3：在0.4的OD600使用质粒pSH16转化的菌株中诱导蛋白表达的结果；泳道4和5：在0.4的OD600使用质粒pSH16和pACYC184-rnpA(sRNA)转化的菌株中诱导蛋白表达的结果；泳道6和7：在0.4的OD600使用质粒pSH32转化的菌株中诱导蛋白表达的结果；泳道8和9：在0.4的OD600使用质粒pSH32和pACYC184-rnpA(sRNA)转化的菌株中诱导蛋白表达的结果。)图3显示了通过SDS-PAGE分析由64个重复序列组成的丝蛋白的表达水平的结果。(泳道1：显示蛋白质标准分子量的标记物；泳道2：在0.4的OD600使用质粒pSH64转化的菌株中诱导蛋白表达的结果；泳道3：在0.4的OD600使用质粒pSH64和pACYC184-rnpA(sRNA)转化的菌株中诱导蛋白表达的结果。)图4a显示了通过SDS-PAGE分析由96个重复序列组成的丝蛋白的表达水平的结果。(泳道1：显示蛋白质标准分子量的标记物；泳道2：在0.4的OD600使用质粒pSH96转化的菌株中诱导蛋白表达的结果；泳道3：在0.4的OD600使用质粒pSH96和pACYC184-rnpA(sRNA)转化的菌株中诱导蛋白表达的结果。)图4b显示了通过分别使用质粒pSH96和质粒pSH96加pTetgly2glyAN-rnpA(sRNA)转化的菌株中诱导蛋白表达所获得的结果，其中，通过SDS-PAGE分析蛋白表达水平，使用光密度计对蛋白表达水平进行定量，然后对蛋白表达水平进行平均。图5显示了通过SDS-PAGE分析由128个重复序列组成的丝蛋白的表达水平的结果。(泳道1：显示蛋白质标准分子量的标记物；泳道2：在0.4的OD600使用质粒pSH128转化的菌株中诱导蛋白表达的结果；泳道3：在0.4的OD600使用质粒pSH128和pACYC184-rnpA(sRNA)转化的菌株中诱导蛋白表达的结果。)图6是显示检测细胞内mRNA水平是否通过降低rnpA基因表达而增加的结果的图。图7是显示通过分批补料培养制备的由96个重复序列组成的丝蛋白的量的图(图7a)，并显示蛋白的电泳结果(图7b)。图8显示了使用本专利技术的降低rnpA基因表达的系统进行的电泳结果，以证实除了丝蛋白外的难表达蛋白表达增加。具体地，图8a显示了通过SDS-PAGE分析苹果酸酶(SfcA)表达水平的结果。(泳道1：显示蛋白质标准分子量的标记物；泳道2：在非转化BL21(DE3)中诱导蛋白表达的结果；泳道3和4：在0.4的OD600使用SfcA转化的菌株中诱导蛋白表达的结果；泳道5和6：在0.4的OD600使用SfcA和rnpA(sRNA)转化的菌株中诱导蛋白表达的结果。)图8b显示了通过SDS-PAGE分析Cat2表达水平的结果。(泳道1：显示蛋白质标准分子量的标记物；泳道2和3：在0.4的OD600使用Cat2转化的菌株中诱导蛋白表达的结果；泳道4和5：在0.4的OD600使用Cat2-rnpA(sRNA)转化的菌株中诱导蛋白表达的结果。)图8c显示了通过SDS-PAGE分析SrtA表达水平的结果。(泳道1：显示蛋白质标准分子量的标记物；泳道2和3：在0.4的OD600使用SrtA转化的菌株中诱导蛋白表达的结果；泳道4和5：在0.4的OD600使用srtA-rnpA(sRNA)转化的菌株中诱导蛋白表达的结果。)图8d显示了通过SDS-PAGE分析CYP73A5表达水平的结果。(泳道1：显示蛋白质标准分子量的标记物；泳道2和3：在0.4的OD600使用CYP73A5转化的菌株中诱导蛋白表达的结果；泳道4和5：在0.4的OD600使用CYP73A5-rnpA(sRNA)转化的菌株中诱导蛋白表达的结果。)图8e显示了通过SDS-PAGE分析CYP98A3表达水平的结果。(泳道1：显示蛋白质标准分子量的标记物；泳道2和3：在0.4的OD600使用CYP98A3转化的菌株中诱导蛋白表达的结果；泳道4和5：在0.4的OD600使用CYP98A3-rnpA(sRNA)转化的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于表达靶蛋白的重组载体，所述重组载体包含编码所述靶蛋白的基因和针对编码核糖核酸酶P的基因的sRNA。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.09 KR 10-2014-01757801.一种用于表达靶蛋白的重组载体，所述重组载体包含编码所述靶蛋白的基因和针对编码核糖核酸酶P的基因的sRNA。2.权利要求1的重组载体，其中所述靶蛋白是难表达蛋白。3.权利要求1的重组载体，其中所述sRNA是针对rnpA基因的sRNA。4.权利要求3的重组载体，其中所述sRNA具有SEQIDNO:1至3任一者所示的核苷酸序列。5.权利要求2的重组载体，其中所述靶蛋白选自丝蛋白、抗体、细胞色素、酶和转肽酶A组成的组。6.一种重组微生物，所述重组微生物中导入权利要求1的重组载体。7.一种重组微生物，所述重组微生物中导入编码靶蛋白的基因和针对编码核糖核酸酶P的基因的sRNA。8.权利要求7的重组微生物，其中所述靶蛋白是难表达蛋白。9.权利要求7的重...

【专利技术属性】
技术研发人员：李相烨，郑汉娜，
申请(专利权)人：韩国科学技术院，
类型：发明
国别省市：韩国;KR