CAR表达载体及CAR表达T细胞制造技术

本发明专利技术的课题在于，提供在T细胞中既表达嵌合抗原受体(CAR)并且还表达T细胞的免疫功能促进因子的CAR表达T细胞、用于制备所述CAR表达T细胞的CAR表达载体，所述CAR表达T细胞的免疫诱导效果和抗肿瘤活性高。本发明专利技术中，制造了下述CAR表达载体和导入了所述CAR表达载体的CAR表达T细胞，所述CAR表达载体含有编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸及编码T细胞的免疫功能促进因子的核酸，其中，所述编码免疫功能促进因子的核酸为：编码白细胞介素7的核酸及编码CCL19的核酸、编码针对SHP‑1的显性负性突变体的核酸、或编码针对SHP‑2的显性负性突变体的核酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】CAR表达载体及CAR表达T细胞
本专利技术涉及CAR表达载体、导入了CAR表达载体的CAR表达T细胞、含有CAR表达T细胞的抗癌剂。
技术介绍
嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptor，以下也称为“CAR”)是将识别癌细胞的细胞表面抗原的单链抗体与诱导T细胞活化的信号转导区融合而得到的人工嵌合蛋白质。如图1所示，通过向不具有肿瘤反应性的通常的末梢血T细胞(末梢血T淋巴细胞)导入编码CAR的基因，从而得以能够大量地制备能够表达CAR的CAR表达T细胞(以下，也简称为“CAR-T细胞”)。该CAR-T细胞具有肿瘤反应性，能够不依赖与主要组织相容性基因复合体(MHC)的相互作用而导致癌细胞的损伤。利用CAR-T细胞的施予的癌症免疫疗法(更具体而言、从患者采集T细胞、将编码CAR的基因导入所述T细胞进行扩增、然后再次植入患者的疗法(参见非专利文献1))，目前正在全世界开展临床试验，在白血病、淋巴瘤等造血系统恶性肿瘤等中得到了呈现有效性的结果。近年来，进行了各种CAR-T细胞的研究。例如，提出了：含有经修饰的自体人T细胞的医药组合物，所述自体人T细胞含有编码由CD19抗原结合区、跨细胞膜区、4-1BB共同刺激信号区、和CD3ζ信号区组成的CAR的核酸(参见专利文献1)；表达1种或多种在治疗上有效的抗标签(tag)嵌合抗原受体(AT-CAR)的T细胞群，其和能与癌细胞结合并且带有1个或多个标签的蛋白质的配合物同时或分别地施予至受试体，并与所述带有标签的蛋白质结合，诱导癌细胞死亡(参见专利文献2)；含有编码包含人抗体139的抗原结合结构域、细胞外铰链结构域、跨细胞膜结构域、及细胞内T细胞信号转导结构域的嵌合抗原受体的核酸的细胞(参见专利文献3)；含有编码嵌合抗原受体的核酸序列的细胞，其中，所述该嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨细胞膜结构域、共同刺激信号转导区及含有SEQIDNO：24的氨基酸序列的CD3ζ信号转导结构域(参见专利文献4)；由基因工程制备的CD19特异性T细胞，其中，在细胞表面膜上表达及保有CD19特异性嵌合受体，所述嵌合受体由用于实现免疫细胞的效应器功能的细胞内信号结构域、至少1个跨细胞膜结构域及至少1个细胞外结构域组成，细胞外结构域包含CD19特异性受体(参见专利文献5)；导入了编码嵌合抗原受体的核酸的嵌合抗原受体表达细胞，所述嵌合抗原受体含有糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)的细胞内结构域作为细胞内结构域(参见专利文献6)。然而，迄今为止的技术中，下述问题尚未解决：CAR-T细胞在生物体内的存活效率较低，或者由CAR-T细胞诱导的内源性T细胞的活化、向肿瘤局部的蓄积不充分的问题；CAR-T细胞的活性被经由PD-L1/PD-1途径(其为癌细胞具有的肿瘤免疫逃逸机制)的免疫抑制信号及癌症微环境中分泌的TGF-β、IL-10等免疫抑制因子抑制的问题。因此，存在无法呈现充分的治疗效果的癌症种类、病例，需要制备更有效的CAR-T细胞、及用于制备所述CAR-T细胞的表达载体。现有技术文献专利文献专利文献1：美国专利申请公开第2014/0106449号说明书专利文献2：日本特表2014-504294号公报专利文献3：日本特表2014-516510号公报专利文献4：日本特表2014-507118号公报专利文献5：日本特开2011-004749号公报专利文献6：国际公开第2013/051718号小册子非专利文献非专利文献1：中泽洋三信州医志(日文：中沢洋三信州医誌)61(4)：197～203(2013)
技术实现思路
在以往的CAR-T细胞中，实施了通过使CAR的信号转导区中含有CD28、4-1BB、CD3ζ等来提高T细胞的激活性能的措施，但利用CAR-T细胞的内源性T细胞的免疫诱导效果、对于肿瘤微环境中的免疫抑制机制的抵抗性没有被充分地强化，利用CAR-T细胞的治疗尚未对实体癌获得效果。因此，本专利技术的课题在于，提供免疫诱导效果和抗肿瘤活性高的CAR-T细胞、及用于制备该CAR-T细胞的CAR表达载体，所述CAR-T细胞在T细胞中既表达CAR同时还表达T细胞的免疫功能促进因子。用于解决课题的手段本申请的专利技术人基于在利用了CAR-T细胞的癌症免疫疗法中达成更优异的免疫诱导效果、抗肿瘤活性的目的，尝试了CAR-T细胞的改良。在此过程中，着眼于作为促进T细胞的免疫功能的因子的细胞因子、趋化因子、信号调控蛋白，构建了既表达CAR同时还表达上述促进T细胞的免疫功能的因子的载体。将所述表达载体导入T细胞，结果发现，可制备具有较之以往的CAR-T细胞而言更优异的免疫诱导效果、抗肿瘤活性的CAR-T细胞，从而完成了本专利技术。即，本专利技术涉及下文公开的内容。(1)CAR表达载体，其含有编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸及编码T细胞的免疫功能促进因子的核酸，其特征在于，所述编码所述免疫功能促进因子的核酸为：编码白细胞介素7的核酸及编码CCL19的核酸、编码针对SHP-1的显性负性突变体的核酸、或编码针对SHP-2的显性负性突变体的核酸。(2)如上述(1)所述的CAR表达载体，其特征在于，编码免疫功能促进因子的核酸为编码白细胞介素7的核酸及编码CCL19的核酸。(3)如上述(2)所述的CAR表达载体，其特征在于，编码CAR的核酸与编码T细胞的免疫功能促进因子的核酸介由编码自切割肽(self-cleavage)的序列连接。(4)如上述(2)或(3)所述的CAR表达载体，其特征在于，编码白细胞介素7的核酸与编码CCL19的核酸介由编码自切割肽的序列连接。(5)如上述(1)～(4)中任一项所述的CAR表达载体，其特征在于，编码CAR的核酸含有编码下述单链抗体的多肽的核酸，所述单链抗体识别FITC或CD20。(6)如上述(1)～(5)中任一项所述的CAR表达载体，其特征在于，编码CAR的核酸含有编码CD8的跨细胞膜区的多肽的核酸。(7)如上述(1)～(6)中任一项所述的CAR表达载体，其特征在于，编码CAR的核酸含有编码CD28的细胞内区、4-1BB的细胞内区、及CD3ζ的细胞内区的多肽的核酸。(8)CAR表达T细胞，其中导入了以下(a)或(b)所示的载体：(a)上述(1)～(7)中任一项所述的CAR表达载体；(b)含有编码CAR的核酸及编码白细胞介素7的核酸的CAR表达载体、和含有编码CAR的核酸及编码CCL19的核酸的CAR表达载体；(9)抗癌剂，其含有上述(8)所述的CAR表达T细胞和药学上允许的添加剂。专利技术的效果通过使用本专利技术的CAR表达载体，能够制造兼具存活能力、淋巴细胞蓄积能力、肿瘤细胞损伤活性的CAR-T细胞、对于癌症微环境中的免疫抑制具有抵抗性的CAR-T细胞。通过利用上述CAR-T细胞实施针对癌症患者的免疫疗法，从而能够获得可期待强效的癌症治疗效果、对于难治性·进行性的癌症仍然有效的癌症免疫疗法。附图说明图1是表示CAR的结构及利用CAR-T细胞的癌症免疫疗法的基本体系的图。图2是表示表达CAR、白细胞介素7(IL-7)及CCL19的载体的图。图3是表示通过流式细胞术对抗FITCCAR-IL-7/CCL19表达T细胞中的CAR表达水平进行确认的结果-1的图。左侧为CAR未染色、右侧为CAR染本文档来自技高网...

【技术保护点】
CAR表达载体，其含有编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸及编码T细胞的免疫功能促进因子的核酸，其特征在于，所述编码所述免疫功能促进因子的核酸为：编码白细胞介素7的核酸及编码CCL19的核酸、编码针对SHP‑1的显性负性突变体的核酸、或编码针对SHP‑2的显性负性突变体的核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.09 JP 2014-2082001.CAR表达载体，其含有编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸及编码T细胞的免疫功能促进因子的核酸，其特征在于，所述编码所述免疫功能促进因子的核酸为：编码白细胞介素7的核酸及编码CCL19的核酸、编码针对SHP-1的显性负性突变体的核酸、或编码针对SHP-2的显性负性突变体的核酸。2.如权利要求1所述的CAR表达载体，其特征在于，所述编码免疫功能促进因子的核酸为编码白细胞介素7的核酸及编码CCL19的核酸。3.如权利要求2所述的CAR表达载体，其特征在于，所述编码CAR的核酸与所述编码T细胞的免疫功能促进因子的核酸介由编码自切割肽的序列连接。4.如权利要求2或3所述的CAR表达载体，其特征在于，所述编码白细胞介素7的核酸与所述编码CCL19的核酸介由编码自...

【专利技术属性】
技术研发人员：玉田耕治，佐古田幸美，安达圭志，
申请(专利权)人：国立大学法人山口大学，
类型：发明
国别省市：日本,JP