一种高通量表达单克隆抗体的线性表达框制造技术

本发明专利技术公开了一种高通量表达单克隆抗体的线性表达框，所述抗体线性表达框包括顺次连接的以下几个表达原件：启动子、抗体信号肽编码序列、连接区编码序列、抗体重链可变区编码序列、抗体重链可变区编码序列、终止子。本发明专利技术利用该抗体线性表达框进行抗体表达的方法使得抗体表达跳过了传统的构建表达载体的步骤，从PCR产物直接转染表达宿主，省去了构建抗体表达质粒的酶切、链接、转化、挑单菌落、细菌培养和质粒提取的过程，一方面将抗体表达周期缩短到3天以内，另一方面可以进行高通量筛选，因此本发明专利技术的研究成果在工业上具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种高通量表达单克隆抗体的线性表达框
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种抗体线性表达框，具体涉及一种可以高通量表达单克隆抗体的线性表达框。
技术介绍
自20世纪80年代以来，单克隆抗体与基因工程抗体技术取得了快速的发展。抗体技术经历了鼠源杂交瘤、噬菌体展示抗体文库技术、核糖体展示抗体文库技术、EB病毒转化B细胞永生化技术、流式分选单个B细胞技术(singlecellsorting)等，使得制备抗体的方式呈现多元化，每个方法都在不断完善相关技术细节，从而使得抗体制备显得相对容易。目前抗体研究方向已从最初的鼠源抗体转向了人源单克隆抗体和基因工程抗体，从专注于单个抗体的功能到研究整个抗体组学的相关信息。同时，随着晶体衍射和冷冻电镜技术的发展，抗体的抗原识别位点和抗体-抗原复合物的三维结构也成为目前研究的一个热点。此外，现阶段大量抗体药物的上市，治疗型抗体也成为一个快速发展的行业。基因工程抗体技术都需要对抗体基因进行克隆和表达，并从海量的待选抗体中筛选出功能特异的目标抗体。高通量构建抗体表达系统和抗体的高通量表达是实现高通量筛选的基础。传统的抗体表达需要将抗体基因克隆到真核表达载体中，然后将真核表达质粒转染到宿主细胞中进行抗体的表达。每个抗体需根据抗体可变区的序列设计两对独特引物，PCR扩增轻链和重链基因，切胶回收基因片段后经特异性酶切位点与表达载体连接、转化感受态菌。然后挑取单个菌落测序，筛选阳性重组克隆，再制备质粒，瞬时转染细胞表达抗体。此过程是一个完整的分子克隆，步骤繁琐，耗时较长，无法实现高通量操作。由于前期筛选的抗体或者单个B细胞的特异性不高，有活性的目的抗体的数量只占全部表达抗体很少的一部分。这使得目的抗体的获得不但费时费力，而且试剂耗材消耗量巨大，前期成本比较大，且实验成功率较低。综上所述，目前制备抗体的方法较多，且比较成熟。而抗体的高通量表达和筛选技术非常单一，从出现基因工程抗体以来，似乎从来没有出现过革命性的变革。不但步骤繁琐、耗时耗力，而且成本很高，最主要是无法实现抗体高通量的表达和筛选，成为制约抗体技术发展的瓶颈。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种诱导抗体快速少量表达的线性表达框，以满足对抗体快速高通量表达以及前期初筛的需求。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种抗体线性表达框，所述抗体线性表达框包括顺次连接的以下几个表达元件：翻译启动子、抗体信号肽编码序列、抗体重链可变区编码序列、连接区编码序列、抗体轻链可变区编码序列、终止子。进一步，所述翻译启动子可以是选自组成型启动子、组织特异性启动子、细胞特异性启动子、响应于生理信号的启动子或可调节启动子中的任意一种，只要可以启动抗体表达的启动子即可。适用于控制抗体编码序列表达的组成型启动子的实例包括但不限于鸡R一肌动蛋白(CB)或来自其他种类的R肌动蛋白启动子、人巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)的早期和晚期启动子、U6启动子、金属硫蛋白启动子、EFla启动子、泛素启动子、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)启动子、二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子，腺苷脱氨酶启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子、丙酮酸激酶启动子、磷酸甘油变位酶启动子、p-肌动蛋白启动子、单纯疽疹病毒的胸普激酶启动子以及本领域技术人员己知的其他组成型启动子。其他启动子可以包括例如人巨细胞病毒(CMV)立即-早期增强子/启动子、SV40早期增强子/启动子、JC多瘤病毒启动子、髓磷脂碱性蛋白((MBP)或神经胶质元纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、单纯疤疹病毒(HSV-1)潜伏相关启动子((LAP)、劳氏肉瘤病毒(RSV)长末端重复序列(LTR)启动子、神经元特异性启动子((NSE)、血小板衍生生长因子(PDGF)启动子、hSYN、黑素浓集激素((MCH)启动子、CBA、神经胶质元纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、基质金属蛋白启动子((MPP)、以及鸡p-肌动蛋白启动子。在本专利技术的具体实施方案中，所述翻译启动子是CMV立即-早期增强子/启动子，序列如SEQIDNO.1所示。进一步，所述抗体信号肽的序列是抗体翻译过程中的前导序列，mRNA转录完成以后，信号肽在核糖体上首先被翻译出来，然后结合信号肽识别颗粒，信号肽识别颗粒将核糖体携带至内质网中继续翻译下游的抗体成分。在信号肽的引导下，新合成的抗体蛋白进入内质网腔进行翻译后修饰，而信号肽序列则在信号肽酶作用下被切除。抗体的信号肽作用如下：1)信号肽能够引导分泌蛋白或膜蛋白出胞；2)信号肽的疏水核心决定蛋白质的分泌效率；3)信号肽能够引导蛋白质在细胞内不同区域或不同细胞器进行正确的定位；4)信号肽能够分泌增强子增强外源蛋白的分泌；5)短的信号欣有利于减少表达载体的分子置，提高整合到宿主染色体上外源基因表达盒的。信号肽在抗体分泌表达过程中起着至关重要的作用，直接影响抗体表达量和翻译后修饰作用。信号肽对抗体分泌的影响非常巨大，不同的抗体家族(如重链的IgG1,2,3和轻链的kappa和lambda)对各自的信号肽又有不同的偏好。已有大量的关于某一抗体信号肽对抗体表达量的影响的报道。本专利技术选择的信号肽是一种抗体通用型信号肽，其特点在于对抗体轻重链家族没有选择性，能够最大限度的将所有目标抗体携带进入内质网进行翻译后修饰。在本专利技术的具体实施方案中，所述抗体信号肽编码序列如SEQIDNO.2所示。进一步，所述连接区的长度和氨基酸的组成没有特别限制，只要其能使抗体重、轻链可变区自由折叠，使抗原结合位点处于适当的构型，并不引起分子动力学改变即可。通常，连接区不影响或不显著影响重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)氨基酸序列形成正确的折叠和空间构象；或者，连接区构成了重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)之间的柔性连接而有利于它们的正常折叠。本专利技术的连接区的序列可以选自：经典的(G4S)3的15个氨基酸的Linker、18个氨基酸的Linker、7个氨基酸的短Linker。有研究表明，单链T细胞受体(sTCR)的ScFv构建时采用较长的Linker可以克服MHC的限制，带有融合蛋白的ScFv也适合使用23，25或29个氨基酸长Linker。目前，在免疫球蛋白超家族ScFv设计时，是否有标准的Linker尚无定论。本专利技术的具体实施方案中选用的Linker为噬菌体展示载体中的linker序列，该连接序列较短，其有效性和活性在噬菌体展示技术中得到了充分的验证，也为现阶段表达ScFv抗体常用的连接区。在本专利技术的具体实施方案中，所述连接区的编码序列如SEQIDNO.3所示。所述连接区序列如SEQIDNO.17所示。进一步，所述终止子可以选自：常用的BGH-Poly(A)，该终止序列在大多数真核表达载体中适用。本专利技术的BGH-Poly(A)选自Invitrogen公司的pcDNATM5/FRT载体，该载体是目前最常用的真核表达载体。在本专利技术的具体实施方案中，所述终止子序列是BGH-Poly(A)，序列如SEQIDNO.4所示。进一步，本专利技术的抗体线性表达框还可以包括有利于抗体检测的标签序列，标签序列包括但不限于C-myc标签、6xHis标签，HA标签，flag标签。在本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗体线性表达框，其特征在于，所述抗体线性表达框包括顺次连接的以下几个表达元件：翻译启动子、抗体信号肽编码序列、连接区编码序列、抗体重链可变区编码序列、抗体轻链可变区编码序列、终止子。

【技术特征摘要】
1.一种抗体线性表达框，其特征在于，所述抗体线性表达框包括顺次连接的以下几个表达元件：翻译启动子、抗体信号肽编码序列、连接区编码序列、抗体重链可变区编码序列、抗体轻链可变区编码序列、终止子。2.根据权利要求1所述的抗体线性表达框，其特征在于，所述翻译启动子序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1所述的抗体线性表达框，其特征在于，所述抗体信号肽编码序列如SEQIDNO.2所示。4.根据权利要求1所述的抗体线性表达框，其特征在于，所述终止子的序列如SEQIDNO.4所示。5.根据权利要求1所述的抗体线性表达框，其特征在于，所述连接区编码序列如SEQIDNO.3所示。6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求1-5中任一项所述的抗体线性表达框。7...

【专利技术属性】
技术研发人员：张黎，卢静，温恬，孟繁岳，胡月梅，朱凤才，
申请(专利权)人：江苏省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：江苏,32