本发明专利技术公开了一种重组α‑半乳糖苷酶基因、载体、工程菌及其应用，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。酿酒酵母是食品安全菌，构建的重组α‑半乳糖苷酶基因酿酒酵母工程菌产α‑半乳糖苷酶，可以进行豆类、糖蜜的发酵加工，可以去除发酵原料中的抗营养因子不良寡糖，提高食品、饲料的营养价值和消化吸收率，提高资源的利用率。酿酒酵母中转入的α‑半乳糖苷酶源于嗜热真菌米赫根毛霉(R.miehei)，有一定的热稳定性。本发明专利技术的工程菌产生的重组α‑半乳糖苷酶则有一定的热稳定性，其最适温度在60℃，在60℃水浴80min后还可以保持80％的活性。
【技术实现步骤摘要】
一种重组α-半乳糖苷酶基因、载体、工程菌及其应用(一)
本专利技术涉及一种重组α-半乳糖苷酶基因、载体、工程菌及其应用，该菌株或产生的酶可以应用于饲料、食品中的抗营养因子的降解，应用于造纸工业中的纸浆预处理、临床医疗中的器官移植或血型改造等。(二)
技术介绍
大豆是重要的食品原料，可以加工成豆奶等营养丰富的食品。豆粕是大豆工业的主要固态副产物，是我国非常重要的饲料原料之一。但是，大豆中含有大量的难以消化的不良寡糖，如棉子糖、水苏糖等α-半乳寡糖。这些不良寡糖是抗营养因子，不能很好地被人或动物吸收利用，而在肠道中经过厌氧发酵产生大量气体，引起腹胀、腹泻、胃肠痛等现象。甘蔗糖蜜是蔗糖生产过程的副产物，其中含有大量的糖分，常被用作工业微生物发酵的培养基碳源。利用糖蜜发酵生产有用的物质不仅可以解决蔗糖生产污染环境问题，而且能够实现资源化利用，具有重要的意义。但是，甘蔗糖蜜还含有一部分不能被酿酒酵母等食品级生物安全微生物利用的糖分，主要由蜜二糖、棉子糖、水苏糖等构成，通常占甘蔗糖蜜总重量的5％。α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)，是一种可以催化α-半乳糖苷键的水解的外切水解酶，催化移除不同底物中α-连接的末端非还原D-半乳糖，水解棉籽糖、水苏糖、半乳甘露聚糖及半乳糖脂等。因此，该酶可以消除豆粕、糖蜜中的棉籽糖和水苏糖等抗营养因子，可以作为添加剂应用于食品、饲料工业，提高食品或饲料的消化吸收率和营养价值。此外，α-半乳糖苷酶还可以用在医疗、造纸业中。细胞溶酶体内α-半乳糖苷酶酶活降低可以引起一种的罕见的遗传性疾病Fabry病。目前，对该病进行α-半乳糖苷酶替代疗法疗效可以得到增强。α-半乳糖苷酶还可以用来水解抗原、改造血型，从而降低异种器官移植、输血过程中的免疫排斥反应。而在造纸工业中，α-半乳糖苷酶可以水解软木中的半纤维成分半乳葡聚甘露聚糖，分离出其中的α-半乳糖，对纸浆预处理有一定的作用。α-半乳糖苷酶在植物(水稻、豆芽、咖啡豆、葡萄等)、细菌(链霉菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、双歧杆菌和巨大芽孢杆菌)中、真菌(根霉、青霉、黑曲霉、米曲霉)等生物中存在。但是，在酿酒酵母、乳酸菌等常用的食品安全级的微生物中，酶活很低，甚至没有该酶。因此，将其他生物来源的α-半乳糖苷酶基因克隆，利用基因工程技术转入酵母菌等，然后进行食品、豆粕的发酵加工，不仅可以去除不良寡糖抗营养因子，还可以提高益生菌的数量，提高食品、饲料品质。此外，转α-半乳糖苷酶基因的酵母菌在培养的时候，可以充分利用糖蜜中的难发酵糖，提高资源利用率。虽有将α-半乳糖苷酶转入毕赤酵母的报道(CN105219791A)，但是毕赤酵母不是饲料、食品等加工的生物安全菌(见《饲料添加剂品种目录(2013)》)，而酿酒酵母是啤酒发酵、酿造、豆粕类加工的可食用生物安全菌。此外，普通的α-半乳糖苷酶热稳定性差，不便于食品、饲料加工。因此，需要构建转α-半乳糖苷酶基因的酿酒酵母，还需要克隆热稳定性好、耐高温的α-半乳糖苷酶基因并转入酿酒酵母。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种重组α-半乳糖苷酶基因及其重组基因工程菌酿酒酵母，该工程菌可以产生α-半乳糖苷酶并应用于食品、饲料加工、生产α-半乳糖苷酶等，可以去除不良寡糖等抗营养因子。酿酒酵母被用于豆类食品加工、豆粕饲料加工等，但是酿酒酵母几乎没有α-半乳糖苷酶活性，不能去除豆类中的不良寡糖。本专利技术构建的重组α-半乳糖苷酶基因酿酒酵母工程菌具有α-半乳糖苷酶活性，可以去除不良寡糖。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种重组α-半乳糖苷酶基因，所述基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供一种所述重组α-半乳糖苷酶基因编码的重组α-半乳糖苷酶，所述酶的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。本专利技术还涉及一种由所述重组α-半乳糖苷酶基因构建的重组载体。本专利技术提供一种由所述重组载体转化制备的重组α-半乳糖苷酶基因工程菌，所述重组α-半乳糖苷酶基因工程菌以酿酒酵母为宿主菌构建而成。本专利技术涉及一种所述重组α-半乳糖苷酶在降解含α-半乳糖苷键底物中的应用，所述的应用是将重组α-半乳糖苷酶基因工程菌接种至添加有含α-半乳糖苷键的底物和诱导物IPTG的YNB筛选培养基，在30℃培养，实现底物的降解，获得降解产物。进一步，所述的底物为标准检验底物(如5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷(X-α-Gal))、含有棉子糖(棉籽糖是一种三糖，由半乳糖、果糖和葡萄糖组成，降解后可能变成二塘、单糖的混合物，彻底降解后变成单糖)、水苏糖的豆粕、糖蜜、食品原料、纸浆等。进一步，当所述的底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷，所述的应用为：将重组α-半乳糖苷酶基因工程菌接种至添加有含α-半乳糖苷键的底物和诱导物IPTG的YNB筛选培养基，在30℃培养，实现底物的降解，获得降解产物5-氯-4-溴-3-吲哚；所述底物以4mg/mL二甲基甲酰胺溶液的形式加入，所述底物溶液与IPTG体积比为1.5:1，所述YNB筛选培养基中，底物终浓度为0.2mg/mL，IPTG终浓度1mmol/L；YNB(ura-)筛选培养基终浓度组成：葡萄糖20g/L、酵母氮碱(YNB)6.7g/L、腺嘌呤0.04g/L、L-色氨酸0.02g/L、L-亮氨酸0.1g/L、琼脂粉15g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然。当所述的底物为棉子糖，所述的应用为：将重组α-半乳糖苷酶基因酿酒酵母工程菌接种至YNB筛选培养基，在30℃、180rpm条件下培养到对数期，然后以体积浓度10％的接种量转接入YPGR诱导培养基中进行表达，30℃培养12h后，将发酵液离心收集细胞后，超声波破碎(美国Sonics公司VCX500超声波破碎仪，破碎参数：在输出功率/频率130W/20KHz，时间为10min，工作3s停3s)后，取破碎混合液与棉子糖溶液以体积比1:1混合，60℃水解反应完全，实现对棉子糖的降解；所述棉子糖溶液是以pH5.5、50mM的MES缓冲液为溶剂配制成0.01g/mL；所述YPGR诱导培养基终浓度组成：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，棉籽糖20g/L，半乳糖20g/L，溶剂为水，pH自然。本专利技术根据报道的源于嗜热真菌米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)的耐热α-半乳糖苷酶基因序列，再加上酵母的分泌信号肽序列，组成重组的分泌型α-半乳糖苷酶全基因。根据全基因序列进行化学合成，克隆到酿酒酵母表达载体，利用基因工程技术转入酵母菌，然后进行豆类、糖蜜的发酵加工，可以去除发酵原料中的抗营养因子不良寡糖，提高食品、饲料的营养价值和消化吸收率，提高资源的利用率。α-半乳糖苷酶是可以催化α-半乳糖苷键水解的外切水解酶，催化移除不同底物中α-连接的末端非还原D-半乳糖，水解棉籽糖家族低聚糖、半乳甘露聚糖及半乳糖脂。α-半乳糖苷酶在含上述α-半乳糖苷键的底物上反应，可以降解底物。X-α-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷)是一种半乳糖苷酶的显色底物，转α半乳糖苷酶基因的酵母菌落产生分泌型的α-半乳糖苷酶，在含该酶底物X-α-gal的平板上降解底物分解成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。蓝色物质可以使整个培养菌落显蓝色，从而说明成功构建了转α-半乳糖苷酶基因的酿本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组α‑半乳糖苷酶基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种重组α-半乳糖苷酶基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。2.一种权利要求1所述重组α-半乳糖苷酶基因编码的重组α-半乳糖苷酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。3.一种由权利要求1所述重组α-半乳糖苷酶基因构建的重组载体。4.一种由权利要求3所述重组载体转化制备的重组α-半乳糖苷酶基因工程菌。5.如权利要求4所述的重组基因工程菌，其特征在于所述重组α-半乳糖苷酶基因工程菌以酿酒酵母为宿主菌构建而成。6.一种权利要求2所述重组α-半乳糖苷酶在降解含α-半乳糖苷键底物中的应用。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷或棉子糖。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷，所述的应用为：将重组α-半乳糖苷酶基因工程菌接种至添...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱廷恒，潘艳青，潘籽龙，孙徽，汪琨，王渭霞，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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