本发明专利技术公开了一种β-半乳糖苷酶的突变体及其制备方法和应用，即将硫矿硫化叶菌（Sulfolobussolfataricus）的β-半乳糖苷酶活性中心附近苯丙氨酸突变为酪氨酸，得到突变体酶F441Y，在优化的突变体酶的酶转化条件下，突变体酶F441Y生产的低聚半乳糖的产率达到61%，较野生酶高10%左右，由此实现了低聚半乳糖产量的提高，具有较高的工业价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种β -半乳糖苷酶突变体及其制备方法，当活性中心位点附近氨基酸发生突变后，得到活性提高的β-半乳糖苷酶，属于基因工程和酶工程领域。
技术介绍
低聚半乳糖(GOs)是一种新型功能性低聚糖，目前已应用于婴儿食品、烘焙食品、 饮料等行业中。据统计，日本目前低聚半乳糖的年产量达6500 7000吨，仅低于低聚异麦芽糖，但年销售额为所有功能性低聚糖之首。在欧美，人们对低聚半乳糖的需求量也日益增长。在我国，低聚半乳糖还是一个新兴行业，尚未形成较大规模。在“九五”以后，在山东禹城，广东江门等地才陆续开始了低聚半乳糖的生产，但产量有限。β -半乳糖苷酶是工业酶法生产低聚半乳糖的主要用酶。β -半乳糖苷酶作用于乳糖的β (1 — 4)糖苷键，形成半乳糖基-酶复合物，在该酶的转苷活力作用下，复合物进一步与半乳糖、二糖或三糖结合，生成低聚半乳糖。不同微生物来源的半乳糖苷酶由于本身性质不同，合成的GOs能力也存在差异，如来源于五coli、A. 巩ir的β -半乳糖苷酶的水解活性较强，而来源于汊circulans、A. oryzae>Kluyveromyces /aeiis的半乳糖苷酶则有较强的转苷活性。目前，国内对半乳糖苷酶研究很多，但多为其水解方面的研究，在转苷活性方面研究相对不足，，且工业化推广少，限制了低聚半乳糖产能的提高。本专利技术所使用的来源于Sulfolobus solfataricus P2的β -半乳糖苷酶虽然在转化过程中能够实现低聚半乳糖的高效生产，但是后提取工艺仍不可缺少。如何提高底物转化率，节约成本，简化后提取工艺将成为β -半乳糖苷酶的研究方向。
技术实现思路
本专利技术提供了一种β-半乳糖苷酶突变体，该突变体是将硫矿硫化叶菌 (.Sulfolobus solfataricus )的β -半乳糖苷酶(NCBI编号AAK43121)活性中心附近氨基酸的取代，与其亲代β -半乳糖苷酶相比，其对乳糖具有更高的转化率。所述β-半乳糖苷酶突变体是441位氨基酸苯丙氨酸突变为酪氨酸，命名为 F441Y。本专利技术应用于低聚半乳糖的生产，最适温度为70°C，最适ρΗ为6. 5。本专利技术在构建的突变株的基础上优化了突变体酶的酶转化条件，实现了低聚半乳糖产量的提高，具有较高的工业价值。使用本突变体生产低聚半乳糖，在最优酶转化条件下，突变体酶F441Y生产的低聚半乳糖的产率达到61%，较野生酶高10%左右。附图说明图1利用野生酶转化乳糖生成低聚半乳糖的最适温度； 图2利用突变酶转化乳糖生成低聚半乳糖的最适温度；图3利用野生酶转化乳糖生成低聚半乳糖的最适Wi;3图4利用突变酶转化乳糖生成低聚半乳糖的最适pH。 具体实施例方式实施例1 本例说明野生β -半乳糖苷酶的制备。、β-半乳糖苷酶的克隆培养硫矿硫化叶菌Ρ2 (购自ATCC，ATCC编号35095)，并提取其总DNA。根据硫矿硫化叶菌的β -糖苷酶的基因hcS基因(NCBI编号AE006641)设计引物正向引物Pl GTCTGCATATGTACTCATTTCCAAATAGC(下划线为酶切位点) 反向引物P2 GAATCTCGAGTTAGTGCCTTAATGGCTTTAC (下划线为酶切位点) 利用上述引物，以硫矿硫化叶菌P2的总DNA为模板，PCR扩增β -半乳糖苷酶基因，反应在50 μ L体系中进行。反应条件为94°C预变性4 min ；随后进行30个循环(94°C 10 s,60°C 5 s，72°C lmin50s) ； 72 °C延伸10 min ；最后4°C保温。扩增得到的PCR片段，经胶回收后，与PMD18- T simple载体连接，并将连接产物转化至大肠杆菌JM109，转化产物涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37°C培养过夜，平板上挑5个菌落，接入LB液体培养基，他后抽提质粒并测序，结果正确。、β -半乳糖苷酶的表达与制备将上述得到的质粒与ΡΤ7-7载体，进行NdeI和B10I双酶切，酶切产物经胶回收后，用 Τ4连接酶16°C连接过夜，连接产物转化至大肠杆菌JM109，经37°C培养过夜，挑选转化子于含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，他后抽提质粒，得到富集的lacS/pT7-7质粒。将质粒lacS/pT7-7转化大肠杆菌BL21 (DE3)细胞，挑选转化子在LB培养基(含 100 yg/mL氨苄青霉素)中37°C液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基(含100 μ g/ mL氨苄青霉素)37°C培养2 h后用4 mg/L IPTG (异丙基硫代-β-D半乳糖苷)诱导，降温至25 ！恒温培养20 h。发酵液于4 0C,8000 rpm离心10 min，收集菌体，用相同体积的pH 6.5 50mmol/ L的磷酸钾缓冲液复溶。于80°C水浴摇床中水浴30min，后IOOOOrpm离心20min，去除沉淀，收集上清液，得到较纯的野生酶。实施例2 本例说明突变体酶F441Y的制备。、定点突变利用快速PCR技术，单突变F441Y的定点突变表达载体hc5/pT7-7为模板，F441Y定点突变引物为正向引物 P3:5，- GATTCTCTATGAGGTATGGTCTGTTAAAGGTCG -3，(下划线为突变碱基) 反向引物 P4 :5，- CGACCTTTAACAGACCATACCTCATAGAGAATC -3，(下划线为突变碱基) PCR反应体系均为2XPrimeSTAR GC Buffer (含Mg2+) 25 μ , dNTPs (各 2.5 mmol/ L) 4 PL，正向引物 Ρ3(10 μΜ) μ ，反向引物 Ρ4(10 μΜ) μ ，模板DNA 1 μ , PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μ 1) 0. 5 μ ，加入双蒸水至 50μ 。PCR扩增条件均为94°C预变性4 min ；随后进行30个循环(94°C 10 s，60°C 5 s，72°C 4 min30s) ； 72°C延伸 10 min ；最后 4°C 保温。PCR产物经/I (购自加拿大!^ermentas公司)消化，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，感受态细胞在LB固体培养基(含100 yg/mL氨苄青霉素)培养过夜后，挑单克隆于LB液体培养基(含100 yg/mL氨苄青霉素)中培养，后提取质粒，突变质粒测序正确。、突变体酶的表达与制备将突变质粒F441Y/pT7-7转化大肠杆菌BL21 (DE3)细胞，挑选转化子在LB培养基(含 100 yg/mL氨苄青霉素)中37°C液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基(含100 μ g/ mL氨苄青霉素)37°C培养2 h后用4 mg/L IPTG (异丙基硫代-β-D半乳糖苷)诱导，降温至25 ！恒温培养20 h。发酵液于4 0C,8000 rpm离心10 min，收集菌体，用相同体积的pH 6.5 50mmol/ L的磷酸钾缓冲液复溶。于80°C水浴摇床中水浴30min，后IOOOOrpm离心20min，去除沉淀，收集上清液，得到较纯的突变酶F441Y。实施例3 本实施例说明利用突变酶转化乳糖生成低聚半乳糖的最适温度。配制60% (w/v)乳糖溶液本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种β－半乳糖苷酶的突变体，其特征是将硫矿硫化叶菌（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ ）的β－半乳糖苷酶活性中心附近苯丙氨酸突变为酪氨酸，所述硫矿硫化叶菌的β－半乳糖苷酶的氨基酸序列与ＮＣＢＩ数据库中硫矿硫化叶菌的β－糖苷酶的基因ｌａｃＳ基因编码的氨基酸序列相同，ｌａｃＳ基因编号为ＡＥ００６６４１。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，陈晟，吴玉飞，陈坚，夏泽华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32
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