本发明专利技术公开了一种β-半乳糖苷酶，它的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。它的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。本发明专利技术还公开了含上述β-半乳糖苷酶基因的表达载体的构建，及重组酶及其在以乳糖为底物的转糖基反应合成低聚半乳糖中的应用。该新型重组β-半乳糖苷酶在大肠杆菌表达体系中具有高效的可溶性表达，且该重组β-半乳糖苷酶在含30％乳糖体系中转糖基反应合成低聚半乳糖产量为47.8％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种β -半乳糖苷酶的新基因及其重组酶和重组酶的应用。
技术介绍
低聚糖(oligosaccharides)又称寡糖，是指由2 10个单糖通过糖苷键连接而成的直链或支链的一类低度聚合糖，它是自然界存在的一类具有广谱化学结构和显著生物功能的有机化合物.低聚糖按其生理功能可分为普通低聚糖和功能性低聚糖，功能性低聚糖主要包括低聚半乳糖、大豆低聚糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖、低聚木糖、甘露低聚糖等，具有良好的双岐杆菌活化效果、能改善便秘、降低血压血脂、增强机体免疫力等功能。β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，EC3. 2. 1.23)，一方面，能将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖；另一方面，在乳糖分子的半乳糖一侧连接1-8个半乳糖，合成低聚半乳糖 (galactooligosaccharide, G0S)。低聚半乳糖是目前各类功能性低聚糖品种中唯一源自动物乳汁中的低聚糖，具有良好的保健功能(1)广谱益生菌增值因子及与其相关的生理功能，例如促进有机酸生成使肠道PH下降抑制外源菌生长、生成大量短链脂肪酸、产生B族维生素等；(2)低甜度低热量，难被人体消化，食用后基本上不增加血糖血脂，但有润肠通便作用；(3)低龋齿性，不被引起龋齿的链球菌所利用；(4)改善脂质代谢，降低总血清胆固醇浓度，提高血清中高密度脂蛋白所占比例；(5)改善矿物元素的吸收利用，促进对钙的吸收，同时使肠道对钠的吸收有降低的倾向，而对钙的吸收有升高的倾向。因此，低聚半乳糖在食品、保健品及医药领域等方面具有广泛的应用潜力。目前，低聚半乳糖合成主要有以下几种方法(1)化学合成由于糖具有活性羟基，传统的化学合成方法因需要繁琐和高选择性的保护和去保护步骤以及保证产品具有立体化学性的困难性使该方法变得不切实际。(2)糖苷转移酶合成利用糖苷转移酶合成低聚半乳糖主要有两方面的问题，一是需要价格昂贵的底物(糖核苷)，二是糖苷转移酶来源有限、产量低、稳定性差；(3)糖苷合成酶作为糖苷水解酶的突变体合成低聚半乳糖，需要活化的氟代糖作为供体才能发生反应，价格昂贵，而天然的底物(如乳糖)无活性不能直接作为供体合成低聚乳糖。(4) β -D-半乳糖苷酶β -D-半乳糖苷酶广泛存在于动植物和微生物内，其催化的糖苷和低聚糖合成反应途径简单，不需要其它辅助因子，反应底物是价格便宜的乳糖，酶容易获得，性质稳定。但是，糖苷酶在合成反应过程中，转糖基新生成的糖苷和寡糖也可以重新被该酶作为底物水解，反应处于水解和合成的动态平衡状态，导致转糖基产物的产率仍然较低，并且还会产生许多不需要的位置同分异构体存在，给产品的分离纯化造成困难。为了打破这个平衡，利用酶反应热力学和动力学原理，加大底物的浓度，采用高浓度的有机溶剂或两相反应体系，降低水的浓度和活度，促使反应向糖苷合成的方向进行，可以提高糖苷产物的得率。与在水溶液中进行的酶催化反应相比，酶在非水相中进行催化反应有如下优越性①有利于疏水性底物的反应；②酶不溶于有机溶剂，容易回收再利用；③使反应热力学平衡从水分解反应转为其逆反应，防止依赖于水的副反应发生，如糖合成、肽合成、酯交换反应等；④能提高酶的稳定性，可扩大反应的适应范围；⑤可控制底物的专一性；⑥没有微生物污染。因此，获得能够耐有机溶剂中的β-D-半乳糖苷酶显得尤为重要。微生物作为 β -D-半乳糖苷酶合成的主要来源，从耐受有机溶剂的微生物中分离耐有机溶剂的酶是一种有效的方法，成为当前的研究热点。考虑到微生物分离培养存在明显的局限性，利用现有的技术，能被培养的微生物比例不足总数的1 %，大量未被培养或不能 被培养的微生物具有巨大的应用潜力。宏基因组方法是从未培养微生物中寻找新型功能基因和活性物质的一种重要手段，至今国内外学者已经通过该技术克隆到单加氧酶、几丁质酶、淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶等新基因，因此该方法为发现半乳糖苷酶新基因提供了新思路。到目前为止，国内外尚未有利用宏基因组技术从海底泥中获得具有高效转糖基性能的β“半乳糖苷酶研究报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种半乳糖苷酶的新基因。本专利技术的第二个目的在于提供上述半乳糖苷酶的宏基因组学克隆方法。本专利技术的第三个目的在于提供含有上述半乳糖苷酶基因的表达载体。本专利技术的第四个目的在于提供利用上述表达载体构建的重组半乳糖苷酶及其制备方法。本专利技术的最后一个目的在于提供上述重组酯酶在将乳糖高效转化为低聚半乳糖混合物中的应用。本专利技术的第一个目的是通过如下技术方案来实现的一种β-半乳糖苷酶，它的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本专利技术提供的上述新型β -半乳糖苷酶，它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。本专利技术的第二个目的是通过如下技术方案来实现的一种半乳糖苷酶的宏基因组学克隆方法，提取海底泥的总DNA并纯化，将纯化后的总DNA经BamHI酶切，连接到克隆载体P Δ LacZ上，电击转化大肠杆菌DH5 α高效感受态建立宏基因组文库，通过涂布含 X-gal的LB平板显色法快速筛选得到阳性克隆子，经测序和BLAST比较并设计引物，从而克隆到目的片段。上述克隆载体P Δ LacZ是通过如下方法获得的用NdeI和SmaI双酶切pUC19质粒去除其中大约200bp的IacZ序列产生约2400bp无IacZ序列，胶回收并用Klenow大片段酶补平末端，用T4DNA连接酶连接并转化Ecoli DH5 α，涂布含氨苄青霉素的LB平板，挑取白斑菌落、摇菌并提取P Δ LacZ质粒。用BamHI单酶切P Δ LacZ质粒，并用碱性磷酸酶 (CIAP,TAKARA)去磷酸化制备载体，具体操作方法参照Alkaline Phosphatase (CIAP)说明书。本专利技术的第三个目的是通过如下技术方案来实现的一种表达载体，所述的表达载体含有上述的半乳糖苷酶基因。本专利技术的第四个目的是通过如下技术方案来实现的一种重组半乳糖苷酶的制备方法，包括用上述表达载体转化表达宿主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组β-半乳糖苷酶。上述重组β-半乳糖苷酶的制备方法中，表达宿主细胞为大肠杆菌。上述重组β -半乳糖苷酶的制备方法，其具体过程为包括用BamHIdindIII双酶切获得目的基因并连接pET-32a(+)载体，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导，得到高效可溶性表达。 所述的IPTG终浓度为0. 6-1. 8mM，诱导温度为18_37°C。本专利技术提供的重组半乳糖苷酶，包括用上述表达载体转化表达宿主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组β “半乳糖苷酶的方法和步骤。本专利技术的最后一个目的是通过如下技术方案来实现的本专利技术所述重组β-半乳糖苷酶在将乳糖高效转化为低聚半乳糖混合物中的应用。本专利技术的有益效果是①.本专利技术从海底泥样品构建好的宏基因组文库中得到一个新的β _半乳糖苷酶的DNA序列，通过基因工程技术对其功能研究，发现该序列在大肠杆菌中高效可溶表达，经蛋白纯化及SDS-PAGE电泳，得到一条单一的蛋白条带，减去融合蛋白，初步确定该β-半乳糖苷酶的分子量约为75KDa。②.本专利技术将SEQ ID NO. 1所示的DNA序列克隆到原核表达载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，通过对阳性克隆子的诱导表达得到重组蛋白，研究其本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种β－半乳糖苷酶，其特征是：它的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘玉焕，刘孝龙，王魁，鲁毅，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81
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