测定α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶活性的方法技术

一种用于测定癌症患者和癌症疑似患者的血浆或血清中α－Ｎ－乙酰氨基半乳糖苷酶活性的方法，其包括将含有α－Ｎ－乙酰氨基半乳糖苷酶活性的血清或血浆进行硫酸铵沉淀以产生沉淀物，将所述沉淀物用柠檬酸盐－磷酸盐缓冲液透析，然后将所述的沉淀物与对－硝基苯基－Ｎ－乙酰基－α－Ｄ－氨基半乳糖苷保温。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及利用克隆的维生素D结合蛋白(Gc蛋白)和克隆的Gc蛋白区域III的低聚糖消化作用，产生有效的巨噬细胞激活因子，以及这些巨噬细胞激活因子在各种癌症、HIV感染和骨质疏松症方面的应用，以及作为免疫接种和接种疫苗的一种佐剂的应用，还研制了利用癌症和HIV感染的患者血液中检测到的特殊酶，α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶的诊断和预后方法。术语Gc蛋白质维生素D3结合蛋白MAF 巨噬细胞激活因子GcMAF Gc蛋白衍生的巨噬细胞激活蛋白GcMAFc 克隆的Gc蛋白衍生的巨噬细胞激活因子Gc domainIIIGc区域IIICdMAF 克隆的区域III衍生的巨噬细胞激活因子NagAg 作为抗原的α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶
技术介绍
A.炎性应答导致巨噬细胞的激活炎症导致巨噬细胞的激活。炎症损伤释放溶血磷脂酰胆碱。把小剂量(5-20微克/鼠)的溶血磷脂酰胆碱(Lyso-Pc)和其它溶血磷脂给小鼠给药能大大增强巨噬细胞的吞噬作用和分泌超氧化物的能力(Ngwenya和Yamamoto，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.193118-124(1990)；Yamamoto，等人，Inf.Imm.615388-5391(1993)；Yamamoto，等人，Inflammation.18311-322(1994)。这种巨噬细胞的激活需要B淋巴细胞和T淋巴细胞和血清的维生素D结合蛋白(DBP；人DBP被称为Gc蛋白)的参与。由Lyso-Pc体外激活小鼠的腹腔巨噬细胞需要通过Lyso-Pc处理的B细胞的β-半乳糖苷酶和T细胞的唾液酸酶对Gc蛋白逐步修饰，可产生巨噬细胞激活因子(MAF)，即携带N-乙酰氨基半乳糖的蛋白质为保留的糖部分的蛋白质(图1a)(Yamamoto，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.888539-8543(1991)；Yamamoto，等人，免疫学杂志。1512794-2902(1993)；Naraparaju，和Yamamoto等人Immunol.Lett.43143-148(1994))。因此Gc蛋白是MAF的一种前体物。用固定的β-半乳糖苷酶和唾液酸酶保温Gc蛋白，产生非常高效价的MAF(GcMAF)(Yamamoto，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.888539-8543(1991)；Yamamoto，等人，免疫学杂志。1512794-2902(1993)；美国专利5177002；美国专利5326749)。以极少量(10pg/鼠，100纳克/人)的GcMAF给药导致巨噬细胞的吞噬作用增强和超氧化物分泌能力提高。用100pg GcMAF/毫升体外处理326个各种癌症病人的外周血液的单核细胞/巨噬细胞(下文称为巨噬细胞)，各种癌症患者的巨噬细胞被激活而具有吞噬作用和分泌超氧化物的能力。该结果表明癌症患者的巨噬细胞能被激活。然而约70％癌症患者的血浆Gc蛋白的MAF前体活性丧失或降低。发现Gc蛋白前体活性丧失或者降低的原因是癌症患者血液里的α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶引导血浆Gc蛋白的去糖基作用。去糖基的Gc蛋白不能转变成MAF(图1b)。这样，Gc蛋白MAF前体活性的丧失阻止了MAF的生成。因此，在一些癌症患者中巨噬细胞并不能被激活。由于巨噬细胞的激活是发生免疫级联过程的第一步。这样的癌症患者就成为免疫抑制者。这至少能部分解释癌症患者死于严重感染的原因。类似地，在体外用100pg的GcMAF/毫升处理了196名HIV感染/AIDS患者的外周血液巨噬细胞，全部患者的巨噬细胞都被激活而具有吞噬作用和超氧化物生产能力。然而约35％的HIV-感染患者的血浆Gc蛋白的MAF前体活性降低。在癌症患者中，这些患者的血浆Gc蛋白被HIV感染患者的α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶进行去糖基作用。这种机制解释了后期HIV感染患者(AIDS)严重免疫抑制的原因。已严重降低了血浆Gc蛋白前体的活性的癌症和HIV感染患者，携带大量的α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶。而中等降低前体活性的患者具有中等水平的血浆α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶活性。具有高前体活性的患者，包括无症状的HIV-感染患者，具有的α-N-乙酰氨基半乳糖酶活性较低，但却显著的水平。既然大量的(260微克/毫升)Gc蛋白存在于血液中，那么低水平酶不能影响前体活性。此外，在各种癌症和HIV-感染患者的血浆中发现α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶并且与其血浆Gc蛋白的前体物活性成倒相关。因此，患者血清或血浆α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶活性的增加会导致血浆Gc蛋白质的前体活性的降低。这些观察使本专利技术人作出如下推断即血清或血浆α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶在对癌症患者和HIV感染的患者/AIDS病患者的免疫抑制中起作用。因此，患者血清或血浆的α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶的活性能作为一种诊断和预后标志。B.巨噬细胞激活级联的缺损表现为骨质疏松症激发炎症的巨噬细胞活化过程似乎是主要的巨噬细胞激活级联。这个过程由其它吞噬细胞如破骨细胞和单核细胞共同分担。在巨噬细胞激活级联中，B淋巴细胞可诱发的β-半乳糖苷酶的缺损引起破骨细胞的功能异常导致表现为骨质疏松症，(Yamamoto等人，免疫学杂志，1525100，1994)，新生儿缺乏或延迟骨髓的形成。常染色体隐性骨质疏松症以大量骨质积累为特征，由于破骨细胞的功能异常，从而导致骨质再吸收的减少(Marks，Clin.Orthop.189239，1984)。在骨质疏松症的动物模型中，根据破骨细胞功能异常的程度，骨髓腔的发育和牙齿的生长要么延迟，要么是常见的缺失(Marks，Am.J.Med.Genet.3443，1989)。在人类早期的骨质疏松症，通常覆盖感染的生命的第一级联出现死亡，表现为免疫抑制(Reeves，儿科学，64202，1979)。累积的证据表明骨硬化的哺乳动物(包括人类)的破骨细胞的缺失或者功能异常经常伴随着巨噬细胞的缺失或功能异常。本专利技术关于在骨硬化变异中破骨细胞和巨噬细胞被激活的研究表明；一种普通的信号因子巨噬细胞激活因子能激活破骨细胞和巨噬细胞，并且缺乏β-半乳糖苷酶的B细胞则不能产生巨噬细胞激活因子(Yamamoto等人免疫学杂志，1525100，1994)。既然GcMAF及其克隆的衍生物能绕过Gc蛋白和淋巴细胞的作用而直接作用于巨噬细胞和破骨细胞上，那么，把这些因子给骨硬化宿主给药，应该能修饰骨质病变。事实上，本专利技术人最近发现把4种GcMAF或者克隆的巨噬细胞激活因子(GcMAFC)(100pg/周)给出生4周的骨质疏松症突变小鼠给药，结果导致巨噬细胞和破骨细胞的激活以及随后吸收过量骨骼母质，并增大了骨髓腔的体积。C.利用GcMAF及其克隆的衍生物治疗癌症的效果尽管癌症，HIV-感染和骨硬化患者的巨噬细胞激活级联缺失，GcMAF能绕过Gc蛋白和淋巴细胞的作用而直接作用于巨噬细胞(或破骨细胞)进行激活。当被活化时，巨噬细胞有消除癌细胞和HIV-感染细胞的潜力。当每个癌症患者每周用100纳克GcMAF治疗几个月后，GcMAF对各种人类癌症都显示了显著的疗效。除了从人类血库中获取GcMAF，也可从克隆的Gc蛋白或能激活巨噬细胞的小区域中获取。克隆的Gc蛋白需要能使克本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：山本信人，
申请(专利权)人：山本信人，
类型：发明
国别省市：