本发明专利技术涉及一种耐热β-半乳糖苷酶突变体的构建。本发明专利技术耐热β-半乳糖苷酶BgaB的突变体BgaB-F341T用于乳糖水解工艺生产低乳糖制品，可以有效去除水解产物对酶水解活性的抑制作用，使水解反应进行彻底提高水解效率；使用耐热乳糖酶β-半乳糖苷酶BgaB的突变体BgaB-F341T替代中温乳糖酶，可以革新低乳糖奶的低温水解工艺。可以将水解温度设定在55-60℃范围，此温度下不仅水解反应速度快，而且牛奶中常见杂菌都已经停止生长，因此能有效控制杂菌污染导致的产品卫生和质量问题；此外，采用耐热乳糖酶的高温水解工艺还可将乳糖水解与巴氏消毒工序合二为一，不仅缩短生产周期，而且可以充分利用巴氏消毒的余热以降低能耗，从而显著节省生产成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种耐热β-半乳糖苷酶突变体的构建。属于蛋白质工程领域。
技术介绍
β -半乳糖苷酶(β -galactosidase)全称为β _D_半乳糖苷半乳糖水解酶 (β-D-galactoside galacto hydrolase,EC3. 2. 1. 23)，商品化的 β _半乳糖苷酶俗称乳糖酶(Lactase)，能催化乳糖或乳糖类似物中β _1，4_半乳糖苷键的水解反应。乳糖酶广泛应用于食品工业、医学和生化分析等领域，其中最大的应用在乳品工业中，可将乳糖降解为葡萄糖和半乳糖以生产低乳糖奶，从而有效解决乳糖不耐症等问题。据流行病调查研究表明， 乳糖不耐症主要是有色人种比例较高，以亚洲人和美国黑人发生率最高。我国居民中约有 75% 95%的人患有不同程度的乳糖不耐受。而欧美的白色人种一般发生率较低，所以乳糖酶的研究在国外并不象蛋白酶、糖化酶等大酶种一样受到重视。但针对中国人的消费特点，乳糖酶就有着重要研究价值和意义。β -半乳糖苷酶广泛存在于动植物和微生物中，其中微生物乳糖酶最具应用价值。 但不同来源的乳糖酶酶学性质差异较大，如黑曲霉、米曲霉等来源的霉菌乳糖酶，催化温度较高(40 55°C )但最适反应pH值较低(pH 3. 0 4. 5)，适合奶酪加工副产物酸性乳清的处理；乳酸克鲁维酵母和脆壁克鲁维酵母等酵母来源的乳糖酶最适反应温度在中温附近 (35 40°C)，而最适反应pH近中性(pH 6. 5 7. 0)，适合牛奶加工中低乳糖奶(pH 6. 5 6.8)的生产；细菌乳糖酶比较复杂，最适反应温度从低温、中温到高温及超高温都有，但一般而言最适反应PH都在中性附近。目前牛奶工业中使用的乳糖酶都是酵母乳糖酶。酵母来源的中温乳糖酶由于最适水解温度在37°C左右，这类酶的反应温度区间恰处于牛奶中常见杂菌的最适生长温度范围，因此工业生产中一般采用低温水解工艺左右)，但仍然存在卫生要求高、用酶量大、生产周期长(一般需20 Mh)和能耗高的缺点。来自嗜热细菌的β-半乳糖苷酶不仅最适反应pH近中性，而且最适反应温度和热稳定性均较高。如果使用这类耐热半乳糖苷酶替代中温半乳糖苷酶，就可以革新低乳糖奶的低温水解工艺。如使用嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热半乳糖苷酶，就可以将水解温度设定在55 60°C范围，此温度下不仅水解反应速度快，而且牛奶中常见杂菌都已经停止生长，因此能有效控制杂菌污染导致的产品卫生和质量问题；此外，采用耐热 β-半乳糖苷酶的高温水解工艺还可将乳糖水解与巴氏消毒工序合二为一，不仅缩短生产周期，而且可以充分利用巴氏消毒的余热以降低能耗，从而显著节省生产成本。现已报道的耐热β -半乳糖苷酶大多来源于极端微生物，如嗜热硫矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、嗜热月旨肪芽抱杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus) 等(Maciunska, J. Czyz, B.Synowiecki, J. Isolation and some properties of beta-galactosidase from the thermophilic bacterium Thermus thermophilus.Food Chemistry. 1998,63 :441-447 ；Pisani, F. Μ. ， Rella, R. ， Raia, C. A. ， Rozzo, et al. . Thermostable beta-galactosidase from the archaeb acteriumSulfolobus solfataricus. Purification and properties.Eur J Biochem,1990, 187,2, 321—328 ；Daabrowski, S. , Sobiewska, G. , Maciunska, J. et al. Cloning, expression, and purification of the His(6)-tagged thermostable beta-galactosidase from Pyrococcus woesei in Escherichia coli and some properties of the isolated enzyme. Protein Expr Purif，2000，19 (1) :107-112)。其中以激烈火球菌耐热 β _ 半乳糖苷酶作用温度最高，其最适作用温度为102 105°C，来源于嗜热栖热菌的半乳糖苷酶其最适反应温度在 87°C左右(Luzhetskyy, A. Weiss, H. Charge, A. et al. A strategy for cloning glycosyltransferase genes involved in natural product biosynthesis. Appl Microbiol Biotechnol，2007，75 (3) :1367-1375)。然而在进行牛奶中乳糖的水解时，β -半乳糖苷酶的最适反应温度并非越高越好，一股认为阳 65°C为比较适宜的工艺条件，过高的水解温度会导致牛奶风味和色泽的改变，并且不能配合巴氏杀菌(Chen，W.， Chen, H. , Xia, Y. , et al. (2008)Production, purification, and characterization of a potential thermostable galactosidase for milk lactose hydrolysis from Bacillus stearothermophilus. J Dairy Sci,91,1751-1758)。
技术实现思路
围绕嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热β -半乳糖苷酶(BgaB)，本课题组进行了源酶和重组酶酶学性质的分析比较、乳糖水解动力学参数、基因工程菌构建、重组表达策略和发酵优化、重组酶固定化方法及固定化酶水解工艺研究，以及BgaB分泌表达策略和分子改良的初步研究。在前期研究中我们发现，BgaB具有良好的热稳定性和高温水解活力，但相比商业化β-半乳糖苷酶其乳糖水解活力比较低。这主要是因为进化过程中乳糖并非原核生物的主要碳源，因而乳糖不是这类β-半乳糖苷酶的最适作用底物。同时，乳糖的水解产物半乳糖和葡萄糖是β -半乳糖苷酶的抑制剂，这就导致乳糖水解过程中，随着水解产物浓度的增大，β-半乳糖苷酶的活性受到抑制并阻碍了乳糖的完全水解。本专利技术目的在于针对现有耐热β -半乳糖苷酶BgaB乳糖水解活力不高，且酶活力受到水解产物的抑制而导致实际生产过程中乳糖不能完全水解、生产效率低的问题，通过现代生物技术手段对嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热半乳糖苷酶BgaB进行分子改良，消除其水解产物抑制作用进而提高水解效率。所谓分子改良是通过改造基因，优化生物性能的方法。本项专利技术的分子改良方法是一种针对蛋白质活性区域采用理性设计与非理性设计相结合的一种创新本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种耐热β－半乳糖苷酶突变体，其特征在于该突变体是采用定点突变的方法以野生型ＢｇａＢ为模板，将该野生型酶的第３４１位氨基酸由Ｐｈｅ被定点突变为Ｔｈｒ，经重组菌Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ６株发酵表达、镍亲和柱得到纯化的耐热β－半乳糖苷酶ＢｇａＢ突变体；该突变体可去除乳糖水解产物半乳糖对酶活性的抑制作用，使乳糖水解率达到１００％。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：董艺凝，王领，陈卫，徐峻，张灏，陈海琴，
申请(专利权)人：江南大学，中山大学，
类型：发明
国别省市：32
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