腺相关病毒变体及其使用方法技术

本公开提供了包含例如衍生自祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列的AAV衣壳蛋白的变体AAV衣壳蛋白的重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒体。本公开的rAAV病毒粒体可表现出更大的靶细胞感染性。本公开还提供了通过向个体施用本公开的rAAV将基因产物递送至个体中的靶细胞的方法。本公开还提供了产生具有衍生自祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列的变体AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体的方法。

Adeno-related virus variants and their use methods

The present disclosure provides a recombinant adeno-associated virus (rAAV) virus particle containing variant AAV capsid protein of AAV capsid protein derived from ancestral AAV capsid protein amino acid sequence. The rAAV virus particles in this public can show greater target cell infection. The present disclosure also provides a method for delivering the gene products to the target cells in the individual by applying the rAAV to the individual. The present disclosure also provides a method for producing a rAAV virus particle that is derived from a variant AAV capsid protein derived from the sequence of the amino acid amino acid of the ancestral AAV capsid protein.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】腺相关病毒变体及其使用方法交叉引用本申请要求于2015年3月24日提交的美国临时专利申请No.62/137,580的权益，该申请的全部内容通过引用并入本文。关于联邦资助研究的声明本专利技术是在由美国国家卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的拨款号HG004483和EY022975的政府支持下进行的。政府对专利技术享有一定权利。引言腺相关病毒(AAV)属于细小病毒(Parvoviridae)科和依赖病毒(Dependovirus)属，其成员在与辅助病毒(例如，腺病毒)共感染时复制。AAV可在没有辅助物的情况下建立潜伏感染。病毒粒体由25nm二十面体衣壳构成，包含具有两个开放阅读框：rep和cap的4.9kb单链DNA基因组。非结构性rep基因编码病毒复制所必需的四种调节蛋白，而cap编码装配成60聚体衣壳的三种结构蛋白(VP1-3)。这种病毒衣壳介导AAV载体克服病毒转导的许多生物学障碍(包括细胞表面受体结合、胞吞作用、细胞内运输和细胞核中的解包装)的能力。概述本公开提供了包含变体AAV衣壳蛋白的重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒体，所述变体AAV衣壳蛋白例如衍生自祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列的AAV衣壳蛋白。本公开的rAAV病毒粒体可表现出更大的靶细胞感染性。本公开还提供了通过向个体施用本公开的rAAV将基因产物递送至个体中的靶细胞的方法。本公开还提供了产生具有衍生自祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列的变体AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体的方法。本公开的一些方面包括含有以下的rAAV病毒粒体：a)变体AAV衣壳蛋白，其中所述变体AAV衣壳蛋白包括与SEQIDNO：16所示序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中在第264、448、459、470、495、533、547、555、557、561、563、593、596、661、662、664、718和723位处的氨基酸分别为A、A、N、S、S、D、E、A、E、L、N、A、A、A、T、T、N和S；分别为Q、S、N、A、S、E、Q、T、D、M、S、Q、T、A、V、S、S和S；或者分别为A、A、T、S、T、D、Q、A、D、I、N、A、T、T、V、S、S和T；和b)含有编码基因产物的核苷酸序列的异源核酸。在某些实施方案中，变体AAV衣壳蛋白包括与SEQIDNO：13所示序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，变体AAV衣壳蛋白包括与SEQIDNO：14所示序列具有至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，变体AAV衣壳蛋白包括与SEQIDNO：15所示序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，当存在于rAAV病毒粒体中时，变体AAV衣壳蛋白赋予rAAV病毒粒体对靶细胞增加的感染性。在某些情况下，靶细胞是肌细胞或神经胶质细胞。在某些实施方案中，与包含野生型AAV血清型衣壳蛋白的AAV病毒粒体对靶细胞的感染性相比，rAAV病毒粒体显示出增加至少5倍的靶细胞感染性。在一些实施方案中，与由野生型AAV血清型衣壳蛋白赋予的依赖性相比，变体AAV衣壳蛋白赋予就感染性而言对靶细胞受体改变的依赖性。在一些实施方案中，与包含野生型AAV血清型衣壳蛋白的AAV病毒粒体相比，rAAV病毒粒体就感染性而言对唾液酸或硫酸肝素蛋白聚糖具有降低的依赖性。在本文讨论的任意实施方案中，基因产物可以是多肽，例如分泌的多肽。在任意实施方案中，多肽可以是肌钙蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、核纤层蛋白、硒蛋白N、蛋白质-O-甘露糖基转移酶、岩藻糖变旋酶、乙酰葡糖胺转移酶样1A(也称为LARGE1)、O-连接的甘露糖β1，2-N-乙酰葡糖胺基转移酶或含类异戊二烯合酶结构域的蛋白质。在本文讨论的任意实施方案中，分泌的多肽可以是脂蛋白脂肪酶、因子IX、α1-抗胰蛋白酶、卵泡抑素、可溶性肌生长抑制素受体、爱帕琳肽、胰高血糖素样肽1、胰岛素样生长因子1、α-半乳糖苷酶、艾杜糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-葡糖苷酶和N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶。在任意实施方案中，基因产物可以是基因组编辑基因产物，包括锌指核酸酶、转录激活子样效应核酸酶(TALEN)和Cas9/引导RNA(gRNA)系统或其组分。在任意实施方案中，基因产物可以是核酸基因产物，包括干扰RNA、核酶、反义核酸或适体。本文还提供了药物组合物，其含有a)根据上文或下文所述的任意实施方案的rAAV病毒粒体，和药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或缓冲剂。本文还提供了将基因产物递送至个体中的靶细胞的方法，所述方法包括向个体施用根据上文或下文所述的任意实施方案的rAAV病毒粒体。在一些实施方案中，靶细胞是肌细胞或神经胶质细胞。本公开的其它方面包括经分离的核酸，其含有编码变体AAV衣壳蛋白的核苷酸序列，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含与SEQIDNO：16所示序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中在第264、448、459、470、495、533、547、555、557、561、563、593、596、661、662、664、718和723位处的氨基酸分别为A、A、N、S、S、D、E、A、E、L、N、A、A、A、T、T、N和S；分别为Q、S、N、A、S、E、Q、T、D、M、S、Q、T、A、V、S、S和S；或者分别为A、A、T、S、T、D、Q、A、D、I、N、A、T、T、V、S、S和T。在一些实施方案中，与含野生型AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒体分别对肌细胞或神经胶质细胞的感染性相比，变体衣壳蛋白在存在于AAV病毒粒体中时提供AAV病毒粒体对肌细胞或神经胶质细胞增加的感染性。本文还提供了分离的、经遗传修饰的宿主细胞，其含有上文或下文所述的任意实施方案的核酸。本文还提供了变体AAV衣壳蛋白，其中变体AAV衣壳蛋白包括与SEQIDNO：16所示序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中在第264、448、459、470、495、533、547、555、557、561、563、593、596、661、662、664、718和723位处的氨基酸分别为A、A、N、S、S、D、E、A、E、L、N、A、A、A、T、T、N和S；分别为Q、S、N、A、S、E、Q、T、D、M、S、Q、T、A、V、S、S和S；或者分别为A、A、T、S、T、D、Q、A、D、I、N、A、T、T、V、S、S和T。在一些实施方案中，与包含野生型AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒体分别对肌细胞或神经胶质细胞的感染性相比，变体衣壳蛋白赋予对肌细胞或神经胶质细胞增加的感染性。本公开还包括产生具有变体AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体的方法，包括对rAAV病毒粒体的初始文库在靶细胞中进行第一轮选择，其中初始文库中的rAAV病毒粒体分别含有具有AAV衣壳蛋白氨基酸序列的初始AAV衣壳蛋白，并且其中所述AAV衣壳蛋白氨基酸序列含祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列的一个或多个可变残基彼此不同的祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列，从而产生具有变体AAV衣壳蛋白的rAAV病毒粒体的第二文库。在一些实施方案中，所述方法还包括通过以下确定祖先AAV衣壳蛋白氨基酸序列：i)重构多种野生型AAV衣壳蛋白氨基酸序列的系统发生树本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒体，其包含：a)变体AAV衣壳蛋白，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：16所示的序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中在第264、448、459、470、495、533、547、555、557、561、563、593、596、661、662、664、718和723位处的氨基酸分别为A、A、N、S、S、D、E、A、E、L、N、A、A、A、T、T、N和S；分别为Q、S、N、A、S、E、Q、T、D、M、S、Q、T、A、V、S、S和S；或者分别为A、A、T、S、T、D、Q、A、D、I、N、A、T、T、V、S、S和T；和b)包含编码基因产物的核苷酸序列的异源核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.24 US 62/137,5801.一种重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒体，其包含：a)变体AAV衣壳蛋白，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含与SEQIDNO：16所示的序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中在第264、448、459、470、495、533、547、555、557、561、563、593、596、661、662、664、718和723位处的氨基酸分别为A、A、N、S、S、D、E、A、E、L、N、A、A、A、T、T、N和S；分别为Q、S、N、A、S、E、Q、T、D、M、S、Q、T、A、V、S、S和S；或者分别为A、A、T、S、T、D、Q、A、D、I、N、A、T、T、V、S、S和T；和b)包含编码基因产物的核苷酸序列的异源核酸。2.一种重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒体，其包含：a)变体AAV衣壳蛋白，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含与SEQIDNO：13所示序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和b)包含编码基因产物的核苷酸序列的异源核酸。3.一种重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒体，其包含：a)变体AAV衣壳蛋白，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含与SEQIDNO：14所示序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和b)包含编码基因产物的核苷酸序列的异源核酸。4.一种重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒体，其包含：a)变体AAV衣壳蛋白，其中所述变体AAV衣壳蛋白包含与SEQIDNO：15所示序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和b)包含编码基因产物的核苷酸序列的异源核酸。5.如权利要求1至4中任一项所述的rAAV病毒粒体，其中所述变体AAV衣壳蛋白赋予对靶细胞增加的感染性。6.如权利要求5所述的rAAV病毒粒体，其中所述靶细胞是肌细胞或神经胶质细胞。7.如权利要求5和6中任一项所述的rAAV病毒粒体，其中与包含野生型AAV血清型衣壳蛋白的AAV病毒粒体对靶细胞的感染性相比，所述rAAV病毒粒体显示出至少5倍增加的对所述靶细胞的感染性。8.如权利要求1至7中任一项所述的rAAV病毒粒体，其中与野生型AAV血清型衣壳蛋白赋予的依赖性相比，所述变体AAV衣壳蛋白赋予就感染性而言对靶细胞受体改变的依赖性。9.如权利要求8所述的rAAV病毒粒体，其中与包含野生型AAV血清型衣壳蛋白的AAV病毒粒体相比，所述rAAV病毒粒体就感染性而言对唾液酸或硫酸肝素蛋白聚糖具有降低的依赖性。10.如权利要求1至9中任一项所述的rAAV病毒粒体，其中所述基因产物是多肽。11.如权利要求10所述的rAAV病毒粒体，其中所述多肽是分泌的多肽。12.如权利要求11所述的rAAV病毒粒体，其中所述分泌的多肽选自由以下组成的组：脂蛋白脂肪酶、因子IX、α1-抗胰蛋白酶、卵泡抑素、可溶性肌生长抑制素受体、爱帕琳肽、胰高血糖素样肽1、胰岛素样生长因子1、α-半乳糖苷酶、艾杜糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-葡糖苷酶和N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶。13.如权利要求10所述的rAAV病毒粒体，其中所述多肽选自由以下组成的组：肌钙蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、核纤层蛋白、硒蛋白N、蛋白质-O-甘露糖基转移酶、岩藻糖变旋酶、LARGE、O-连接的甘露糖β1，2-N-乙酰葡糖胺转移酶和含类异戊二烯合酶结构域的蛋白质。14.如权利要求1至9中任一项所述的rAAV病毒粒体，其中所述基因产物是基因组编辑基因产物。15.如权利要求14所述的rAAV病毒粒体，其中所述基因组编辑基因产物选自由以下组成的组：锌指核酸酶、转录激活子样效应核酸酶(TALEN)和Cas9/引导RNA系统或其组分。16.如权利要求1至9中任一项所述的rAAV病毒粒体，其中所述基因产物是核酸基因产物。17.如权利要求16所述的rAAV病毒粒体，其中所述核酸基因产物是干扰RNA、核酶、反义核酸或适体。18.一种药物组合物，其包含：a)根据权利要求1至16中任一项所述的重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒体；和b)药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或缓冲剂。19.一种将基因产物递送至个体中的靶细胞的方法，所述方法包括向所述个体施用根据权利要求1至17中任一项所述的重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒体。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述靶细胞是肌细胞或神经胶质细胞。21.如权利要求19和20中任一项所述的方法，其中所述基因产物是多肽。22.如权利要求21所述的方法，其中所述多肽是分泌的多肽。23.如权利要求22所述的方法，其中所述分泌的多肽选自由以下组成的组：脂蛋白脂肪酶、因子IX和α1-抗胰蛋白酶、卵泡抑素、可溶性肌生长抑制素受体、爱帕琳肽、胰高血糖素样肽1、胰岛素样生长因子1、α-半乳糖苷酶、艾杜糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-葡糖苷酶和N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶。24.如权利要求21所...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·S·欧加拉，J·桑蒂阿格欧蒂兹，O·韦斯特桑，D·V·沙弗尔，I·H·霍尔米斯，J·温斯特恩，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US