一种重组质粒及其用于构建红曲色素高产菌株的方法技术

本发明专利技术提供了一种重组质粒及其用于构建红曲色素高产菌株的方法，该技术方案首先从植物双元质粒pCambia0380载体出发，改造并构建了一种适合丝状真菌表达的双元质粒载体pNeo0380。在此基础上，从米曲霉中克隆得到α‑淀粉酶基因，与质粒载体连接后，通过根癌农杆菌EHA105介导将其转化至野生型的红色红曲霉中，构建得到了红曲色素高产菌株，该菌株可显著促进底物大米淀粉的降解，从而提高红曲色素产量。与此同时，本发明专利技术围绕重组菌株的生物学特性设计了专用于生产淀粉酶和专用于生产红曲色素的两种发酵方法，所产淀粉酶活性及红曲色素产量均显著高于野生型菌株，同时提升了红曲色素中醇溶性成分的比例。

【技术实现步骤摘要】
一种重组质粒及其用于构建红曲色素高产菌株的方法
本专利技术涉及工业微生物
，进一步涉及基因工程技术以及霉菌的发酵技术，具体涉及一种重组质粒及其用于构建红曲色素高产菌株的方法。
技术介绍
红曲色素是由微生物红曲霉菌(Monasusspp.)，以大米为原料发酵而成的天然色素，在我国有一千多年的历史。作为食品添加剂，红曲色素广泛应用于食品加工和化妆品制造等领域；因其还具有广泛的生物活性如调血脂、降血压、防血管硬化、抗糖尿病、抑制肥胖、抗炎症、抗过敏、防过氧化、抗癌、抗细菌、抗真菌等，它在益生保健产品开发和医疗领域的应用也越来越受到重视。红曲色素是红曲霉的次级代谢产物，由脂肪酸合成途径和聚酮合成途径共同完成合成代谢。其化学结构主要分为聚酮和脂肪酸链两部分。脂肪酸链的合成以乙酰CoA为前体，经脂肪酸合酶(Fattyacidsynthase，FAS)复合体作用，经过一系列合成反应形成中长链脂肪酸，其与乙酰CoA反应生成β-酮酸；聚酮的合成同样以乙酰CoA为前体，在聚酮合酶(Polyketidesynthase,PKS)作用下，依次合成多聚酮体化合物，最终形成带有生色基团的聚酮。聚酮的羧基基团与脂肪酸链的羟基基团发生酯化反应，从而形成红曲色素。基于以上原理，为了提高红曲色素的产量，现有技术普遍通过发酵工艺改良来实现红曲霉的代谢调控，进而定向累积目的产物；尽管发酵条件的优化能在一定程度上改善红曲色素产量，但受限于红曲霉自身的代谢特性，红曲色素累积很难再进一步提高。此外，红曲霉所产红曲色素分为醇溶性色素和水溶性色素。醇溶性色素为红曲霉在发酵过程中直接合成，存在于胞内；水溶性色素是红曲霉自身合成的色素与发酵液中氨基酸等物质结合形成的复合色素，分布于胞外。在天然菌株的生长过程中，这两种红曲色素均有产生，单纯凭借培养方法无法实现定向生产其中一种红曲色素。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种重组质粒及其用于构建红曲色素高产菌株的方法，以解决现有技术中常规培养红色红曲霉产红曲色素时产量较低的技术问题。本专利技术要解决的另一技术问题是现有技术中常规培养红色红曲霉产红曲色素时难以定向累积醇溶性红曲色素。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种重组质粒，是由以下方法构建的：1)取植物双元质粒pCambia0380，用限制性内切核酸酶HindIII与BglII酶切，而后将序列为SEQIDNo:1、SEQIDNo:2的一对寡核苷酸序列通过T4DNA连接酶与之连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G；2)以质粒pUR5750为模板，以序列为SEQIDNo:3、SEQIDNo:4的一对引物进行PCR扩增，得到gpdA启动子片段，用限制性内切核酸酶BamHI与PstI同时酶切所述gpdA启动子片段和双元质粒表达载体pCambia0380G，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G-gpdA；3)以质粒pMD19-TtrpC-PtrpC-Neo为模板，以序列为SEQIDNo:5、SEQIDNo:6的一对引物进行PCR扩增，得到终止子及Neo筛选标记片段，用限制性内切核酸酶BglII与SpeI同时酶切所述终止子及Neo筛选标记片段和双元质粒表达载体pCambia0380G-gpdA，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pNeo0380。作为优选，步骤1)中所述的一对寡核苷酸序列依次含有以下限制性核酸内切酶位点：HindIII、KpnI、SacI、PacI、PmeI、XhoI、XbaI、BglII。同时，本专利技术提供了应用上述重组质粒构建红曲色素高产菌株的方法，包括以下步骤：A)以米曲霉NRRL3488的cDNA为模板，以序列为SEQIDNo:7、SEQIDNo:8的一对引物进行PCR扩增得到α-淀粉酶A基因，用限制性内切核酸酶HindIII与SacI同时酶切所述α-淀粉酶A基因和双元质粒表达载体pNeo0380，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pNeo0380-amy；B)用根癌农杆菌EHA105介导双元质粒表达载体pNeo0380-amy，转化至红色红曲霉(Monascusruber)菌株中，筛选阳性克隆，即得到所述红曲色素高产菌株。作为优选，步骤B)所述红色红曲霉菌株是红色红曲霉CICC41233株。作为优选，步骤B)具体包括以下操作：先制备感受态的根癌农杆菌EHA105，再通过液氮冻融法将所述双元质粒表达载体pNeo0380-amy导入根癌农杆菌EHA105，而后将含有双元质粒表达载体pNeo0380-amy的根癌农杆菌EHA105转化至红色红曲霉菌株中，再筛选阳性克隆，即得到所述红曲色素高产菌株。作为优选，所述制备感受态的根癌农杆菌EHA105，包括以下步骤：将根癌农杆菌EHA105接种于5～10mL含有50μg/mL利福平的YEP液体培养基中，以温度28℃、搅拌转速200rpm的条件培养24h；取lmL活化的菌液接种于20mL含有50μg/mL利福平的YEP液体培养基中，以温度28℃、搅拌转速200rpm的条件培养至菌液OD600值0.5；将菌液冰浴30min后，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清；用0.15mmol/L的氯化钠溶液l0mL重悬沉淀，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清，而后悬浮于20mmol/L的氯化钙溶液1mL中。作为优选，所述通过液氮冻融法将所述双元质粒表达载体pNeo0380-amy导入根癌农杆菌EHA105，包括以下步骤：取1μg所述双元质粒表达载体pNeo0380-amy加入到200μL感受态的根癌农杆菌EHA105中，混合后冰浴30min；液氮中速冻1min，37℃水浴3min，再冰浴2min；加入800μLYEP液体培养基，28℃培养3h；常温下以5000rpm的转速离心3min，浓缩菌体；取200μL浓缩后的菌液涂布于含有50μg/mL利福平、50μg/mL卡那霉素的YEP选择性培养基平板上，28℃倒置培养2d；挑选转化子于YEP液体培养基中培养，并用引物对克隆子进行筛选，得到阳性克隆子，即为含有双元质粒表达载体pNeo0380-amy的根癌农杆菌EHA105。作为优选，所述将含有双元质粒表达载体pNeo0380-amy的根癌农杆菌EHA105转化至红色红曲霉菌株中，包括以下步骤：取红色红曲霉菌株，用MPS固体培养基培养7d，获取分生孢子，用无菌水悬浮孢子，振荡分散孢子，经2层擦镜纸过滤，调节孢子浓度；取含有双元质粒表达载体pNeo0380-amy的根癌农杆菌EHA105，接种于3mL含有50μg/mL利福平、50μg/mL卡那霉素的YEP培养基中，28℃培养48h，而后转接于5mL含有200μmol/L乙酰丁香酮的AIM诱导培养基中，使菌液稀释至OD600值为0.15，再继续培养5～6h，至OD600值为0.5～0.6；将以上所得的红色红曲霉孢子液和含有双元质粒表达载体pNeo0380-amy的根癌农杆菌EHA105菌液，混合涂布于含200μmol/L乙酰丁香酮的AIM诱导培养基平板上，25℃，避光培养48h。作为优选，所述筛选阳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组质粒，其特征在于是由以下方法构建的：1)取植物双元质粒pCambia0380，用限制性内切核酸酶Hind III与Bgl II酶切，而后将序列为SEQ ID No:1、SEQ ID No:2的一对寡核苷酸序列通过T4DNA连接酶与之连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G；2)以质粒pUR5750为模板，以序列为SEQ ID No:3、SEQ ID No:4的一对引物进行PCR扩增，得到gpdA启动子片段，用限制性内切核酸酶BamH I与Pst I同时酶切所述gpdA启动子片段和双元质粒表达载体pCambia0380G，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G‑gpdA；3)以质粒pMD19‑TtrpC‑PtrpC‑Neo为模板，以序列为SEQ ID No:5、SEQ ID No:6的一对引物进行PCR扩增，得到终止子及Neo筛选标记片段，用限制性内切核酸酶Bgl II与Spe I同时酶切所述终止子及Neo筛选标记片段和双元质粒表达载体pCambia0380G‑gpdA，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pNeo0380。...

【技术特征摘要】
1.一种重组质粒，其特征在于是由以下方法构建的：1)取植物双元质粒pCambia0380，用限制性内切核酸酶HindIII与BglII酶切，而后将序列为SEQIDNo:1、SEQIDNo:2的一对寡核苷酸序列通过T4DNA连接酶与之连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G；2)以质粒pUR5750为模板，以序列为SEQIDNo:3、SEQIDNo:4的一对引物进行PCR扩增，得到gpdA启动子片段，用限制性内切核酸酶BamHI与PstI同时酶切所述gpdA启动子片段和双元质粒表达载体pCambia0380G，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G-gpdA；3)以质粒pMD19-TtrpC-PtrpC-Neo为模板，以序列为SEQIDNo:5、SEQIDNo:6的一对引物进行PCR扩增，得到终止子及Neo筛选标记片段，用限制性内切核酸酶BglII与SpeI同时酶切所述终止子及Neo筛选标记片段和双元质粒表达载体pCambia0380G-gpdA，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pNeo0380。2.根据权利要求1所述的一种重组质粒，其特征在于步骤1)中所述的一对寡核苷酸序列依次含有以下限制性核酸内切酶位点：HindIII、KpnI、SacI、PacI、PmeI、XhoI、XbaI、BglII。3.应用权利要求1所述重组质粒构建红曲色素高产菌株的方法，其特征在于包括以下步骤：A)以米曲霉NRRL3488的cDNA为模板，以序列为SEQIDNo:7、SEQIDNo:8的一对引物进行PCR扩增得到α-淀粉酶A基因，用限制性内切核酸酶HindIII与SacI同时酶切所述α-淀粉酶A基因和双元质粒表达载体pNeo0380，而后通过T4DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒表达载体pNeo0380-amy；B)用根癌农杆菌EHA105介导双元质粒表达载体pNeo0380-amy，转化至红色红曲霉菌株中，筛选阳性克隆，即得到所述红曲色素高产菌株。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤B)具体包括以下操作：先制备感受态的根癌农杆菌EHA105，再通过液氮冻融法将所述双元质粒表达载体pNeo0380-amy导入根癌农杆菌EHA105，而后将含有双元质粒表达载体pNeo0380-amy的根癌农杆菌EHA105转化至红色红曲霉菌株中，再筛选阳性克隆，即得到所述红曲色素高产菌株。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述制备感受态的根癌农杆菌EHA105，包括以下步骤：将根癌农杆菌EHA105接种于5～10mL含有50μg/mL利福平的YEP液体培养基中，以温度28℃、搅拌转速200rpm的条件培养24h；取lmL活化的菌液接种于20mL含有50μg/mL利福平的YEP液体培养基中，以温度28℃、搅拌转速200rpm的条件培养至菌液OD600值0.5；将菌液冰浴30min后，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清；用0.15mmol/L的氯化钠溶液l0mL重悬沉淀，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清，而后悬浮于20mmol/L的氯化钙溶液1mL中。6.根据权利要求4所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙传南，曾斌，张冬生，谢韶斌，
申请(专利权)人：江西科技师范大学，
类型：发明
国别省市：江西,36