用于扩增结核分枝杆菌耐药相关基因的引物对组合产品制造技术

本发明专利技术涉及一种用于扩增结核分枝杆菌耐药相关基因的引物对组合产品，其选自如下引物对组合中的任一组或两组：第一组，包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1‑10所示的引物对中的一对、多对或全部；第二组，包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：11‑18所示的引物对中的一对、多对或全部；其中，每种引物对单独放置，且每对引物对中的上游引物和下游引物单独或混合放置。本发明专利技术所提供的9对引物对可以在两个反应体系中就完成9种基因的扩增，从而可以快速、准确地根据检测结果进行结核分枝杆菌耐药相关基因的检测。

Primer pair combination products for amplification of drug-resistant genes in Mycobacterium tuberculosis

The invention relates to a method for amplification of Mycobacterium tuberculosis drug resistance related gene of combination products, the primer pairs selected from any group or combination of two groups: the first group includes nucleotide sequence respectively as primer SEQ ID NO:1 10 shown on one of the many, or all of the second; group, including nucleotide sequences as primers of SEQ ID respectively NO:11 18 shown on one of the many, or all of them, each primer pair; a separate place, and each pair of primers on the upstream primer and downstream primer alone or mix. The 9 pairs of primers provided by the invention can amplify 9 kinds of genes in two reaction systems, so as to rapidly and accurately detect the drug-resistant genes of Mycobacterium tuberculosis according to the detection results.

【技术实现步骤摘要】
用于扩增结核分枝杆菌耐药相关基因的引物对组合产品
本专利技术涉及医学检验领域，具体而言，涉及一种用于扩增结核分枝杆菌耐药相关基因的引物对组合产品。
技术介绍
结核病(tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌感染引起的一种严重威胁人类健康的传染性疾病。目前结核病耐药形式严峻。据估计全球约20％的结核分枝杆菌分离株至少耐一种主要的抗结核药物，更严重的是耐多药结核病、广泛耐药结核病、甚至全耐药结核病也已经出现并日趋增多。我国是结核病高负担国家，耐药疫情也十分严峻。据统计，我国新发和复发结核病例中耐多药结核病分别占5.7％和25.6％，其中约8％为广泛耐药结核病病人，均高于全球平均水平。因此，耐药结核病的快速诊断成为我国的重大需求，而如何简单、方便地获得耐药相关基因成为耐药结核病分子诊断的关键基础环节。研究发现，结核分枝杆菌耐药相关基因发生一些位点发生错义突变是导致结核病耐药的一个重要原因。已经明确的这些耐药相关基因主要包括：与利福平耐药相关的rpoB基因，与异烟肼耐药相关的katG基因和inhA，与乙胺丁醇耐药相关的embB基因，与吡嗪酰胺耐药相关的pncA基因，与喹诺酮类药物耐药相关的gyrA基因，与链霉素耐药相关的rpsL基因，与卡那霉素和卷曲霉素耐药相关的rrs基因和eis基因。基于现代分子生物学技术的耐药基因突变检测技术可以快速检出病人体内结核分枝杆菌的耐药性，从而指导临床及时选择有效药物。而现代分子生物学技术的关键环节是这些耐药相关基因的简单、便捷和大量的获得，其中应用最广的是聚合酶链式反应(PCR)技术。PCR技术是扩增并获得目的基因的应用最为广泛的实验技术，是目前分子检测的基础。但是单一PCR反应每次只能扩增一个基因，实际工作要完成上述多样本的九个耐药基因检测，工作量巨大。多重PCR(multiplexPCR)通过在同一反应体系里加入两对对以上的引物，可以在同一反应管中实现对多个核酸片段的扩增，在提高通量、保持高特异性和高敏感性的同时，能大大降低成本、节省标本，使分子生物学技术更加简单、快速和高效。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种引物对组合产品，所述的引物对组合产品可在两个多重PCR反应体系中扩增9个结核分枝杆菌耐药相关基因。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：本专利技术涉及一种引物对组合产品，其选自如下引物对组合中的任一组或两组：第一组，包括核苷酸序列分别如SEQIDNO：1和2、SEQIDNO：3和4、SEQIDNO：5和6、SEQIDNO：7和8、SEQIDNO：9和10所示的引物对中的一对、多对或全部；第二组，包括核苷酸序列分别如SEQIDNO：11和12、SEQIDNO：13和14、SEQIDNO：15和16、SEQIDNO：17和18所示的引物对中的一对、多对或全部；其中，每种引物对单独放置，且每对引物对中的上游引物和下游引物单独或混合放置。SEQIDNO：1和2、SEQIDNO：3和4、SEQIDNO：5和6、SEQIDNO：7和8、SEQIDNO：9和10分别用于扩增embB、katG、rrs、rpoB、mabA/inhA五个基因；SEQIDNO：11和12、SEQIDNO：13和14、SEQIDNO：15和16、SEQIDNO：17和18分别用于pncA、eis、gyrA、rpsL四个基因。本专利技术针对目前比较明确的结核分枝杆菌耐药基因，设计并优化了引物序列，建立起针对上述九个基因的多重PCR反应体系。通过进一步评估其扩增临床分离株DNA的效果，证明引物与反应体系的在实际使用中的有效性，成为进一步研发结核病耐药基因检测产品的基础。该多重PCR反应具有通量高(每管分别为5重和4重PCR)，组合合理(条带大小分明)，反应条件一致(9对引物使用同一条件)，产物分子数接近的特点。本专利技术还涉及一种组合物，其含有如上所述引物对组合产品中的第一组。所述组合物为将第一组中的引物的混合物，其可以为固体干粉状产品，也可以为混合溶液。优选的，如上所述的组合物，序列如SEQIDNO:1～10所示的引物之间的摩尔比依次为：1.0～1.4:1.0～1.4:0.6～1.0:0.6～1.0:0.4～0.8:0.4～0.8:1.0～1.4:1.0～1.4:0.4～0.8:0.4～0.8；更优选的，序列如SEQIDNO:1～10所示的引物之间的摩尔比依次为：1.1～1.3:1.1～1.3:0.7～0.9:0.7～0.9:0.5～0.7:0.5～0.7:1.1～1.3:1.1～1.3:0.5～0.7:0.5～0.7；更优选的，序列如SEQIDNO:1～10所示的引物之间的摩尔比依次为：1.2:1.2:0.8:0.8:0.6:0.6:1.2:1.2:0.6:0.6。本专利技术还涉及一种组合物，其含有如上所述引物对组合产品中的第二组。所述组合物为将第二组中的引物的混合物，其可以为固体干粉状产品，也可以为混合溶液。优选的，如上所述的组合物，序列如SEQIDNO:11～18所示的引物之间的摩尔比依次为：0.6～1.0:0.6～1.0:0.6～1.0:0.6～1.0:0.4～0.8:0.4～0.8:0.4～0.8:0.4～0.8；更优选的，序列如SEQIDNO:11～18所示的引物之间的摩尔比依次为：0.7～0.9:0.7～0.9:0.7～0.9:0.7～0.9:0.5～0.7:0.5～0.7:0.5～0.7:0.5～0.7；更优选的，序列如SEQIDNO:11～18所示的引物之间的摩尔比依次为：0.8:0.8:0.8:0.8:0.6:0.6:0.6:0.6。本专利技术还涉及一种试剂盒，其包含如上所述的引物对和探针的组合产品；和/或；如上所述的组合物(第一组)；和/或；如上所述的组合物(第二组)；所述试剂盒可以选自如上所述的引物对和探针的组合产品，但不含有上述的组合物(第一组和第二组)；也可以不含有如上所述的引物对和探针的组合产品，而含有上述的组合物(第一组和/或第二组)；所述试剂盒优选还包括PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、水、上样缓冲液以及DNA分子量内标中的一种或多种。优选的，如上所述的试剂盒，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4DNA聚合酶以及Klenow片段中的任一种。优选的，如上所述的试剂盒，所述水选自双蒸水或去离子水。优选的，如上所述的试剂盒，所述上样缓冲液选自甲酰胺或去离子甲酰胺。本专利技术还涉及如上所述的引物对组合产品、如上所述的组合物(第一组)、如上所述的组合物(第二组)或如上所述的试剂盒在制备用于结核分枝杆菌耐药性检测的试剂中的应用。本专利技术还涉及使用如上所述的引物对组合产品、如上所述的组合物(第一组)、如上所述的组合物(第二组)或如上所述的试剂盒进行结核分枝杆菌耐药性检测的方法，所述方法包括以下步骤：(1)将制备好的DNA模板与SEQIDNO：1-18所示的引物(第一组或第二组分开进行)、PCR反应缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和去离子水混匀，进行PCR反应；(2)电泳检测PCR扩增产物。在一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种引物对组合产品，其选自如下引物对组合中的任一组或两组：第一组，包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：5和6、SEQ ID NO：7和8、SEQ ID NO：9和10所示的引物对中的一对、多对或全部；第二组，包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：11和12、SEQ ID NO：13和14、SEQ ID NO：15和16、SEQ ID NO：17和18所示的引物对中的一对、多对或全部；其中，每种引物对单独放置，且每对引物对中的上游引物和下游引物单独或混合放置。

【技术特征摘要】
1.一种引物对组合产品，其选自如下引物对组合中的任一组或两组：第一组，包括核苷酸序列分别如SEQIDNO：1和2、SEQIDNO：3和4、SEQIDNO：5和6、SEQIDNO：7和8、SEQIDNO：9和10所示的引物对中的一对、多对或全部；第二组，包括核苷酸序列分别如SEQIDNO：11和12、SEQIDNO：13和14、SEQIDNO：15和16、SEQIDNO：17和18所示的引物对中的一对、多对或全部；其中，每种引物对单独放置，且每对引物对中的上游引物和下游引物单独或混合放置。2.一种组合物，其含有权利要求1所述的引物对组合产品中的第一组。3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，序列如SEQIDNO:1～10所示的引物之间的摩尔比依次为：1.0～1.4:1.0～1.4:0.6～1.0:0.6～1.0:0.4～0.8:0.4～0.8:1.0～1.4:1.0～1.4:0.4～0.8:0.4～0.8。4.一种组合物，其含有权利要求1所述的引物对组合产品中的第二组。5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，序列如SEQIDNO:11～18所示的引物之间的摩尔比依次为：0.6～1....

【专利技术属性】
技术研发人员：孙照刚，李自慧，潘丽萍，吕翎娜，孙琪，张洪静，许绍发，张宗德，夏学良，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京胸科医院，
类型：发明
国别省市：北京,11